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台式离心机制备鸡卵类粘蛋白

   [目的]

    1.掌握利用台式离心机从鸡蛋清中提取卵类粘蛋白的方法。

    2.了解台式离心机凝胶层析法的工作原理,掌握台式离心机基本操作技术。

 

    [原理]

    鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白,存在于鸡蛋清中。它在中性或偏酸性溶液中对热及高

浓度的脲、有机溶剂都有较高的耐受性,但在碱性溶液中不稳定。在50%丙酮或10%三氯乙酸镕液中仍然有较好的溶解度。通常选择合适的PH值及适当浓度的丙酮或三氯乙酸,在运用台式离心机进行凝胶层析分离,可以从鸡蛋消中除去非卵类粘蛋白.从而达到纯化鸡卵类粘蛋白的目的。

 

    台式离心机进行凝胶层析分离时,含盐或其它小分子的蛋白质混台溶液,在经过凝胶层析柱时,大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿颗粒问的空隙以较快的速度流过凝胶柱而最先流出柱外,但相对分子量较低的盐或其它小分子物质因为进入凝胶颗粒的微孔中,所以向下移动的速度较慢,而最后流出柱外。所以通过凝胶层折可达到除去小分子物质(盐)的目的,具体可以参考凝胶气泡处理离心机层析技术。

 

    本实验先将鸡蛋清用三氯乙酸-丙酮溶液处理,台式离心机离心后去除沉淀物,然后由丙酮分级

沉淀获得粗品,经台式离心机凝胶层析对卵类粘蛋白提取液纯化,再经DEAE—纤维素柱层析精制得到合格产品。最后用累丙烯酰胺凝胶电泳检验提取的鸡卵类枯蛋白的纯度。

 

    [实验器材]

    (1)试管及试管架。

    (2)烧杯。

    (3]玻璃棒。

    (4)酸度计。

    (E)恒温水浴。

    (6)温度计。

    (7)电冰箱。

    (8)漏斗。

    (9)布氏漏斗。

    (10)台式离心机等。

 

    [材料与试剂]

 

    (1)新鲜鸡蛋。

 

    (2)葡聚糖凝胶SefhadexG—25(50—100目)。

 

    (3)丙酮

 

   (4)0.5mol/L三氮乙酸(TCA)。

 

   (5)0.02mol/L磷酸缓冲液(PH6.5)。

 

    (6)1mol/L氯化钠。

 

    (7)2mol/L盐酸。

 

    (8)DEAE-纤维素(DE-32)。

 

    (9)0.5mol/L NaOH-0.5mol/L HCl(V/V=1:1)。

 

    (10)标准胰蛋白酶溶液(100μg/ml):称取10mg标准胰蛋白(预先经凯氏定氮法测定其含量),加入0.01mol/L盐酸使其溶解,定容至100ml。

 

    (11)2mol/L盐酸。

 

    (12)0.06%N-苯甲酰-DL-精氨酸-β一荼酰胺(BANA):称取BANA 60mg,溶解于20ml 95%乙醇中,再用pH7.8,0.2mol/L磷酸缓冲液稀释至10ml。

 

    (13)0.1%亚硝酸钠:称取亚硝酸钠100mg,加蒸馏水溶解后,用容量瓶定容至100ml等。

 

    [操作方法]

 

    1.卵类粘蛋白的抽提

 

    (1)取鸡蛋一只,在其底部轻磕一小洞,使蛋清沿小洞慢慢流下,将蛋清液收集到一烧杯

中(注意不要使蛋黄混入)。取鸡蛋清50ml,在30℃水浴中,缓慢加入等体积的0.5mol/L 三

氯乙酸—丙酮溶液(三氯乙酸:丙酮=1:2),边加边搅拌,约30min加完,最后溶液的pH=

3.5,继续搅拌30min,置于冰箱中静置4h以上。

 

    (2)利用台式离心机进行离心,台式离心机转速控制在2500 r/min,4℃离心20min,弃去沉淀,清液再用滤纸过滤,以除去其中的脂类物质及其它不溶性物质。收集滤液并放入500m1烧杯中。

 

    (3)检查滤液的pH值是否为3.5,若相差大,则应调回到PH3.5,置冰箱或冰浴下冷却片刻。

 

    (4)在冰浴下缓慢加入3倍体积的丙酮,用玻璃棒轻轻搅匀,用塑料簿膜盖好。以减少丙酮的挥发。在冰浴中放置2h。

 

    (5)倾出部分上清液,其余全部转移至离心管中.利用台式离心机转速3000r/min,4℃离心15min,倾出上清液,将离心管底部的沉淀物放在真空干燥器内,抽气,除去残留丙酮,然后用5ml蒸馏水溶解,若溶解液混浊,可用滤纸滤去不溶物,将溶解液用SefhadexG—25层析柱脱盐或者透析除盐。

 

    2.凝胶层析对卵类粘蛋白提取被的纯化

 

    (1)凝胶的预处理

    为使样品通过凝胶时流速稳定并得到很好的分离效果,应该对凝胶进行预处理。称

取SefhadexG—25凝胶,用0.02mol/L的磷酸缓冲液(PH6.5)500ml热溶胀2h或室温溶胀24h。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌,以防凝胶交联结构的破坏。上柱前将处理好的凝胶于真空干燥器中抽气20-30min。

 

    (2)柱的选择

    层析柱一般由玻璃管或有机玻璃管制成,层析柱必须粗细均匀,为了防止利用离心机进行分离时受管壁效应的影响,一般应选用内径大于2.5cm的柱子。柱高也要适当,一般用做脱盐时柱高不超过50cm。本实验采用3.5cm x 30cm的层析校。层析柱的底部可放置少量的玻璃纤维或焊接一个砂芯滤板,其下再铺一层尼龙布以防止葡聚糖颗粒流出。

 

    (3)装柱

 

    装柱是凝胶层折中虽重要的环节.操作时凝胶必须装得十分均匀,中间不要有气泡。首先必须将柱子垂直地安装好。取0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)40ml倒进柱内,待流出20一30ml后关闭柱子下端的螺旋夹。然后将脱气后的凝胶用玻璃棒沿壁小心地缓缓倒进柱内。尽量一次装完,以免出现不均匀的凝胶断层。待凝胶沉降4—5min后打开螺旋夹,待凝胶沉降至床高20cm处,用吸管吸出过剩的凝胶。用50—100ml 0.02mol/L—磷酸缓冲液(pH6.5)冲洗凝胶柱.使柱床稳定,然后在凝胶表面放一片干净的滤纸,以防加祥时凝胶被冲起。特别要注意在任何时候都不要使液面低于凝胶表面,否则凝胶变干,并有可能产生气泡,从而影响液体在柱内的流动。上样前要用上述缓冲掖平衡凝胶柱,当流出

液在紫外分光光度计测出的280nm吸光值小于0.02时,可停止平衡,开始上样。

 

    (4)上样

    为了获得较好的分离效果,上样量要小,最多不能超过床体积的25%一40%。加样前,关闭往下端的螺旋夹,用移液管慢慢地吸走凝胶上层的缓冲液,待床面只留下薄薄一层液体时开始加样。用移液管吸取5m1鸡卵类粘蛋白的祖提液小心地加到凝胶床上。并取走盖在凝胶上的滤纸。打开校下口的螺旋夹,待样品完全进入凝胶后.加少量的磷酸缓冲液润洗凝胶表面,待液体完全流进床内后,关闭螺旋央,开始洗脱收集。

 

    (5)洗脱

    在贮液瓶中加入0.02mol/L磷酸缓冲液(PH6.5),控制滴加速度,保证凝胶上方液面高度为l0cm。用下口螺旋夹调节流速为0.2-0.5ml/min,打开分部收集器每l0min收集一管(3ml/管),用紫外分光光度计测定各管收集液的OD280值,以管号为横坐标,OD值为纵坐标绘出洗脱曲线,并收集蛋白峰。

 

    (6)将收集的蛋白均液体放置冰箱,准备进一步用DEAE柱层析纯化。

 

   3.鸡卵类粘蛋白的精制

 

    (1)DEAE—纤维素的处理

    称取DEAE-纤维素10g,以150ml 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20min后转移到布氏漏斗(内垫200目的尼龙网)中抽滤,并用蒸馏水洗至中性,抽去水分,移至烧杯中。再用150ml 0.5mol/L HCl浸泡20m,然后移至布氏漏斗中抽滤并以蒸馏水洗至中性(大约PH6.0)。最后例在烧杯中用150ml 0.02mol/L磷酸缓冲液(PH6.5)浸泡片刻,于真空干燥器中脱气、装柱、以同一缓冲液平衡。

 

    (2)上样

    取经上述纯化后的卵类粘蛋白粗品上样,上样后以0.02mol/L磷酸缓冲液(PH6.5)淋

洗,去除杂蛋白,并检测收集液在紫外分光光度计下的OD280小于o.02时即可洗脱。

 

    (3)洗脱

    改用含0.3mol/L NaCl的0.02mol/L磷酸缓冲液(PH6.5)洗脱。控制流速为0.2ml/min,打开部分收集器,每10min收集一管(2m1/管)。将各管收集液在280nm下测定吸光值并绘制洗脱曲线,收集蛋白蜂。

    (4)透析除盐

    将收集的蛋白溶液放入透析袋内,进行透析用1%AgNO3检查无氯离子时,停止透析。

 

    (5)丙酮沉淀

    将透析好的卵类粘蛋白液用1mol/L HCl调节pH至4.o,除留出少量样品作测定鸡卵类粘蛋白含量外。其余透析液中加入3倍体积的预冷丙酮,盖上塑料薄膜,在冰浴里静置4h。待鸡卵类粘蛋白全部析出。

 

    (6)台式离心机离心

    倾出上清,然后将沉淀物装在台式离心机的50ml离心管中3000r/mim离心15min。去上清液,将沉淀物干燥,得到的透明胶状物为鸡卵类粘蛋白。