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影响细胞分离的因素——细胞间的相互作用

由于细胞间存在氧键、范德华力等的作用,在介质中相似类型和同种类型的细胞总是相互吸引、相互靠近而形成凝块。这种凝集作用直接影响细胞的沉降状态,严重的凝块会妨碍纯化并使获得细胞的产率减少。首先,使一些细胞从细胞种群中丢失;其次,凝聚作用改变了细胞大小和密度。由沉降方程可知,明显增大的凝块比同种类型的单细胞沉降快t若凝聚的细胞团块密度超过它所处支撑梯度中等密度区的密度,区带会变得不稳定,分界面变形,更严重的是会产生混合带,形成潮流,影响细胞分离的分辨力。

细胞间的这种凝集作用是影响样品最大装载量的一个关键性因素,样品层中细胞含量过高,细胞间距离短t碰撞机会增加,容易促使凝块的形成。管壁效应、梯度分界面效应、离心机转速、温度、所使用介质、细胞间的重叠密度等都会对细胞间的凝聚产生直接影响。

如果把细胞间的相互作用减少,则能降低凝聚作用,提高梯度容量。在实践中,除去介质中的二价离子,能够有效地减少细胞的黏附,使细胞处于悬浮状态。大多数大分子介质如牛血清白蛋白在中性pH时会增加细胞间的相互作用,促使凝块的形成。在确定离心时,要保证它足以克服介质的浮力和黏滞力,在适当时间内达到细胞相互分离或使整个系统达到平衡。所施加的离心力也要足以克服细胞集结在一起的力,同时也要减少对细胞的压力效应,防止破坏细胞。所以离心力不是越大越好,在实验时要根据具体情况来定。

减少细胞凝块所采用的方法包括采用低细胞密度,给介质中加入一些抗凝成分,如白蛋白、血清、DNase(降低凝胶作用)、蛋白酶或者EDTA等。在某些情况下,在4℃下操作会减少凝块,但一些研究者在分离实质性肝细胞时得出不同结论,他们在分离步骤中一开始把温度调整到20℃会大大降低凝聚作用。