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淋巴细胞的分离技术

(一)材料与试剂

    1.淋巴细胞分层液有两种:

 (1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用时,用蒸馏水配制9%溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。

 

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制:

9%聚蔗糖液                 24份

33.9%泛影葡胺液            10份

混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G

混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存。一般可保存3个月。

如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:

式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。

(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液

  34%泛影葡胺液               10份

  60%右旋糖酐液               12.5份

混合,即为比重1.07~1.09的分层液。分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用。

2. 3%的明胶液  称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min。

3.Hank’s液。

(二)操作方法

1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆。如是牛、羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆。

2.2 000r/min离心10min,弃上清。

3.沉淀用Hank’s液混悬后,再2 000r/min离心10min。

4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群,包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。

5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可。

6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层。

7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中。

8.以Hank’s液洗涤、离心,最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。

(三)注意事项

1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。

2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离。

3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞。