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亲和吸附载体的活化与偶联方法图示

亲和吸附的载体由于其相对的惰性,往往不能直接与配基连接,偶联前一般需要先活化,活化方法很多,下面对几种常见的方法加以介绍。


①溴化氰活化法

亲和吸附载体,如琼脂糖、葡聚糖等,在碱性条件下用溴化氰处理,其活化过程见下图,可引入恬泼的“亚氨基碳酸盐”中间体,再在弱碱的条件下直接与舍有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶联,形成N取代的亚氨基碳酸盐、氨基甲酸酯和异脲衍生物。

多糖载体溴化氰活化过程

溴化氰活化多糖,特别是活化琼脂糖的简单方法如下:在通风橱内将一定量的琼脂糖与等体积的水混合,并加入装有pH电极、磁力搅拌器的反应器中,另取事先充分粉碎的溴化氰(每毫升琼脂糖加50~300mg CNBr)加入到上述悬浮液中,立即用NaOH调节pH至11。整个反应要求pH维持在11±0.1,温度维持在20℃左右,反应在3~l2min内完成。反应结束后,将大量的冰屑迅速加入到反应液中,并迅速倾入布氏漏斗,用琼脂糖体积10~15倍量的冷缓冲液抽滤洗涤,缓冲液应与下步偶合反应所用的缓冲液相同。商品滇化氰为白色结晶,熔点51.3℃,沸点61.3℃,室温下易挥发产生剧毒和有刺激性的蒸气,因而全部操作应在通风橱中进行。


②高碘酸氧化法

多糖被0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应24h会产生醛,在温和条件下,醛受赖氨酸上的e-NH2的亲核攻击,生成希夫碱,接着用硼氢化钠还原,生成稳定的烷基胺。

多糖载体到稳定烷基胺的过程

用高碘酸盐氧化的多糖载体与配基偶联程度与用溴化氰活化一样。但当配基为蛋白质类化合物时,配基的偶联效果不如用溴化氰活化的方法好。


③环氧化法

在热的浓碱溶液中,多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物。在碱性条件下,其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。另外也有用双环氧衍生物对载体进行活化的方法,但它易使琼脂糖凝胶自身交联,这种交联虽促使它在碱性溶液中的稳定性增强,但吸附的通透性却受到限制,尤其一些稳定性较差的蛋白质不能采用这类活化载体。

亲和吸附多糖载体-环氧氯丙烷-活化载体过程


④甲苯磺酰氯法

甲苯磺酰氯法是一种较为理想的多糖类载体活化方法。反应在无水丙酮中进行,以吡啶为催化剂。这个方法的主要优点有:活化反应方便、迅速,产物含量可用紫外测定,并能在水中贮存,配基偶联条件温和,产物稳定,与酶偶联效率高,一般在60%~80%。

甲苯磺酰氯法示意图


⑤双功能试剂法

利用二乙烯砜等双功能试剂,对琼脂糖类多糖的活化有许多优点:

反应速率快,条件温和,能与氨基、糖类、酚、醇类等偶联。在与琼脂糖作用的同时,二乙烯砜自身会聚合,活化后的产物需用水充分洗涤。二乙烯砜也会使琼脂糖交联,使载体刚性增加。已活化的载体在碱性条件下不稳定,易分解。

亲和吸附-双功能试剂法



⑥聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法

这类载体具有大量可修饰的酰氨基,能在较广的pH范围内稳定位用。聚丙烯酰胺的酰氨基能被含氮化合物(乙二胺、水合阱等)置换产生游离氨,或经碱水解制备多种衍生物。

聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法