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组织与细胞匀浆中匀浆介质的介绍

在分离细胞器时,要将切碎的组织或培养的细胞置于一特定的介质里进行匀浆。细胞在匀浆过程中,细胞膜破裂、细胞器完全暴露于匀浆介质里。因此要求匀浆介质对游离的细胞器起到保护作用,防止由于外环境改变加之匀浆过程的剪切作用使细胞器遭到结构破坏或功能发生变化,因此在选择匀浆介质时应考虑它的缓冲容量、pH值、离子强度、渗透压和对膜的保护作用。

首先应该考虑缓冲容量和pH值,缓冲容量要足以使在整个制备过程中pH值保持恒定,匀浆介质的缓冲容量应大于细胞破裂时胞内蛋白质和其他溶质的缓冲容量。离子强度应根据不同细胞器来选择,由于质膜、线粒体等即使在低离子强度下都会发生交叉凝聚,因此通常不加入离子介质,而高离子强度对细胞核膜的稳定则会起到一定的保护作用,但有时也利用高离子强度的匀浆介质,例如使用钙离子或镁离子沉淀来分离腔质膜(luminal plasma membrane)。渗透压不能随意改变,尤其对渗透敏感细胞器像膜囊泡,它们对渗透性改变敏感,甚至会包裹匀浆介质,对随后分离影响很大。表8-2列举了破碎哺乳组织的几种匀浆介质。表8-3列举了几种植物组织的匀浆介质。另外,根据所研究的目的,匀浆介质中也应加入一定量的蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂等。

匀浆介质使用举例

通常使用最多的等渗梯度介质是0.25mol/L蔗糖,其中加入Tris、Hepes、Tes等起到缓冲作用,pH 一般在7.0~8.0之间。一般来讲要分离的目的细胞器不同,匀浆介质应该不同,像分离线粒体,单独使用蔗糖加缓冲介质是可以的,但加入甘露醇或山梨醇或同时都加入会得到更好的分离效果,有时也将甘露醇与山梨醇直接用作匀浆介质来分离线粒体。阳离子常与线粒体蛋白质发生相互作用使之聚集,要避免使用。加入EGTA、EDTA等可以螯合金属离子,加入牛血清白蛋白(BSA)以除去游离脂肪酸和溶血磷脂,对分离线粒体有一定好处。

分离粗面内质网通常选用0.25~0.5mol/L,蔗糖溶液作为匀浆介质。为了定量游离膜结合多聚核糖体,给匀浆介质中加入Mg2+;为了防止RNA降解,加入RNase抑制剂,有时利用高速离心上清灌的RNase抑制剂活性也收到了很好的效果。

但对于细胞核的分离来说,匀浆介质中加入各种阳离子则是必需的,阳离子的作用是稳定核膜、避免溶胀。最常用的介质中含有0.25mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl、50mmol/LMgCl2和25mmol/l KCl,但由于细胞核密度大,也常使用高渗介质,例如0.32mol/L蔗糖,加入5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L CaCl2,只要有镁盐和钙盐存在,肝脏细胞核就会处于一种紧密状态。

根据以上可以看出,分离不同的细胞器和细胞膜要选用不同的介质,但在研究组织或细胞的组成时,常用一种介质进行全部分离,其目的是易于对回收量进行评价。植物组织所用浓度一般高于哺乳组织(表8-3)。

植物组织的匀浆介质