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为什么纯DNA的A260/A280=1.8?

前段时间,科研狗师兄带着一师妹做实验,师妹是新手,做的实验室质粒大提之后的浓度测定。


       科研狗:“我们通过紫外分光计来测定浓度,测定后看A260/A280值,这个值是判断质粒是否污染的重要标准,一般在1.8-2.0左右,如果低于1.8表示有蛋白质污染。”

科研狗一脸自信,用极快的语气说出了这句话,仿佛这就是1+1=2的简单。

小师妹:“为什么A260/A280就能代表纯度呢?”小师妹一脸崇拜但又有些疑问。

科研狗:这个原因呢,怎么和你说呢,说深奥了怕你听不懂,说简单了又说不明白。你现在先自己去查查资料,待会儿先和我说说你查到的资料,然后我再和你讲解。

科研狗暗自庆幸自己的机智,因为他自己也不是十分明白,如何毫无破绽地隐藏自己也不会,这就是一门学问了

等待小师妹出去查询的时刻,科研狗迅速掏出手机,在百度中输入了“A260/A280”。

一会儿功夫,小师妹过来了,向科研狗师兄汇报其查找学习到的资料。

”由于DNA和蛋白质含有共轭双键,能够吸收不同波段的紫外,DNA吸收在260nm左右,蛋白质吸收在280nm左右,所以A260/A280如果过低,代表样品有蛋白质污染“,小师妹娓娓道来。

“你说的很有道理,但是没有本质上说明A260/A280代表DNA纯度,为什么纯的DNA的A260/A280应该在1.8左右?“,科研狗以一种胸有成竹的语气说道。

“这个我也想弄清楚,没有查到“,小师妹畏缩地说:”师兄你就直接告诉我吧“。

你今晚回去学习学习,这是对你自我学习能力的一种锻炼“,科研狗理直气壮地说:”师兄是为了更好地教你做科研啦,明天早上告诉我你查到的结果“。

其实,科研狗师兄用手机也没查到更多的资料,但是不怕啊,有一整个晚上的时间留给科研狗去学习!

读到这里,你是否明白,当你问师兄师姐问题的时候,他们让你回去自己查查,不能否认这是对你们自身能力的一种锻炼,另外一种可能是 ——他们也不会。


       既然说到这,科研狗本着科研的精神,一定把这件事情整明白了。

首先,蛋白质DNA为什么能吸收紫外?

这是因为DNA中的嘌呤和嘧啶具有共轭双键,-C=C-C=C-,蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,根据共轭双键的数目和种类就会主要吸收(DNA主要吸收260nm,并不代表其他波长就不吸收了)不同波长的紫外,至于为什么会这样,这就是大一学的无机化学里介绍的,会涉及到电子轨道、共轭、大π键等等,科研狗不愿多说,说多了都是泪。

其次,纯的DNA紫外吸收波段是怎样的?

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上图中大概是碳水化合物(230),DNA(260),蛋白质(280)的紫外吸收示意图(请忽略<200nm或者>400nm波长的曲线)。


再次:为什么纯的DNA紫外吸收A260/A280在1.8左右?

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正如上图所示,因为DNA的吸收曲线是比较固定的,因此V1/V2既(A260/A280)比值基本恒定,这个比值在1.8左右,所以我们常说的A260/A280的1.8的值就是由此而来。

最后:含有蛋白质污染的DNA自我吸收图谱是怎样的?

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上图事宜了DNA中含有蛋白质污染了,因为蛋白质吸收波长主要在280左右,这会导致曲线会在280处有一个上升的趋势,使得V1'/V2' 的比值下降,既我们常说的”如果A260/A280小于1.8,则有蛋白质污染“。


在测定中我们经常还会看见A260/A230,A230是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染。


下面罗列出一些参考范围:

DNA:260/280     1.8-2.0

260/230       2.5左右

RNA:260/280       2.0左右

260/230 2.5左右


内容来源:微信号 - 科研狗