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配置密度梯度溶液的方法

配置密度梯度溶液,一般情况下是先配制高浓度储备液,再用缓冲液稀释到需要的浓度,阶梯梯度配制若干个不同密度的溶液,连续梯度一般配制两种密度的溶液,其中一种是梯度的最大密度,另一种是梯度的最小密度。


用各种离心机转子在梯度介质中分离颗粒时,使用两种形式的梯度,即自形成梯度和预形成梯度。自形成梯度是梯度介质在离心场作用下颗粒重新分布,形成从顶部到底部逐渐增加密度的液柱。预形成梯度是指在离心之前,用梯度形成仪或人工的方法预先制备密度梯度柱按照梯度结构可分为不连续梯度(即阶梯度)和连续梯度两种类型。连续梯度又有线性梯度、指数梯度、对数梯度和复合梯度。有时为了速率区带离心分离的方便,又设计了等动力梯度,为了防止在区带转子中的径向稀释,设计了等体积梯度。配置密度梯度溶液需要注意很多事项。

 

碱金属盐溶液在4℃下可以长期保存,但含碘的物质应避光保存,多元醇易受微生物污染,保存在-20℃使用时不方便。最好临时配置。

 

有些使用冷冻离心机进行离心需要在无菌条件下进行,但高压消毒对有些梯度介质会带来一些不利影响,如引起Percoll颗粒不稳定,配制时可只对稀释剂进行消毒,碘化梯度介质中只有Metrizamide可以进行高压消毒。

 

溶解多糖是先给粉剂里加入少许水搅拌,使之成为半透明的糊状,再稀释到所需体积。如果直接把大量水或缓冲液加到多糖粉剂里,会形成大量凝块。

 

可用比重瓶或折射仪测定梯度溶液的密度和所有介质的密度分布,用下述方程能快速精确地根据折射率计算溶液的密度:

ρ=An-B

式中,A和B的值随着梯度介质和温度的变化而不同,如用0.8% NaCl、120mmol/L Tricine-NaOH配制的等渗Iodixanol梯度中,A=3.2984,B=3.3967。

储存液与稀释剂间通过混合得到的溶液密度可用下式计算:

图片1.png


式中,D为所需密度;V为储存液的体积;d为储存液的密度;V1为稀释液的体积;d1为稀释液的密度。