中国一流的离心机生产企业
专注生物医疗、实验室离心机

通过离心机进行正加速度对肠黏膜通透性影响的方法

肠道是机体与外界直接发生联系的组织之一。肠道不断遭受各种抗原刺激物 (如食物蛋白、 细菌及其降解产物等) 的损伤, 所以必须具有超强的抗损伤能力及阻碍各种有害物质进入机体的功能。肠道的这种屏障功能称为肠道屏障。肠道屏障由机械屏障、 生物屏障、 化学屏障及免疫屏障组成。随着对肠道屏障研究的逐渐深入, 许多学者发现, 机械屏障是肠道屏障最为重要的组成部分, 其功能的正常发挥主要依赖于肠黏膜上皮细胞及细胞间紧密连接的完整性, 当肠道黏膜完整性受损, 通透性增高时,血清中 D- 乳酸及二胺氧化酶 (di am i ne oxi dase,DAO) 水平也明显升高, 二者是反映肠黏膜机械屏障功能的良好指标。随着现代高性能战斗机的不断发展, 对战斗机的机动性要求越来越高, 使得飞行员在飞行过程中必须承受远远超出人类生理耐受力的加速度,对飞行员的身体健康造成极大威胁, 据统计, 在航空航天医学中, 消化系统疾病位居飞行员住院原因的前 3 位, 加速度暴露对机体的影响与防护依然是目前航空航天医学的主要研究课题之一。本研究通过模拟正加速度 (posi t i ve accel erat i on,+Gz ) 模型, 检测 +Gz暴露下大鼠外周血 D- 乳酸及DAO 水平, 以探讨 +Gz暴露对大鼠肠黏膜机械屏障的损伤及机制, 进而为飞行员肠病的防治提供依据。

材料与方法

实验动物及分组

32 只雄性 SD 大鼠[ 中国军事科学院实验动物中心, 许可证号: SCXK- (军 )-2015-0004] , 体重 (180±10 ) g。 领回大鼠后适应性喂养 1 周。 喂养条件:中央恒温下饲养, 温度 (23±2 )℃, 保持定时通风及适当湿度, 食用大小鼠维持饲料 (北京科澳协力饲料有限公司 ) , 自由饮食。 将大鼠随机分成 4 组, 分别标记为正常对照组(A 组) 、 +5 Gz组(B 组) 、 +10 Gz组 (C组 ) 、 重复暴露组(D组)组, 每组8只。

试剂与仪器

动物离心机, 由航天航空医学研究所提供, 动物离心机是在地面条件下模拟飞行时加速度的设备,离心机转臂半径 1 m , 采用梯形 +Gz作用曲线, G 值增长率一般为 1 G/ s, 由计算机程序进行控制, 可模拟出不同加速度值、 增长率和作用时间。DAO 试剂盒,购自南京建成科技有限公司, D- 乳酸试剂盒,购自博世生物技术有限公司。 台式离心机、 925 低温冰箱、 分光光度仪、 戊巴比妥钠、 无菌动物手术器械均由航天航空医学研究所提供。

正加速度暴露方法

实验离心机模拟 +Gz暴露。实验时采用特制的固定装置承载实验动物, 将实验动物俯面固定于离心机转臂远端, 头朝向离心机轴心方向,每只实验动物专用 1 个固定盒。每次 4 只大鼠同时上机。A 组大鼠不做处, B 组大鼠以 +5 Gz旋转5 m i n, C 组大鼠以 +10 Gz旋转 5 m i n, D 组大鼠暴露于 +5 Gz 1. 5 m i n, +10 Gz 2 m i n, +5 Gz 1. 5 m i n。 每日暴露 1 次, 持续 5 d。

标本采集与指标测定

+Gz暴露 5d 后所有大鼠禁食不禁水 12 h, 称重量后用 3% 戊巴比妥钠按 1. 5 m l / kg 腹腔内注射麻醉, 固定大鼠, 剃毛后沿大鼠腹正中线打开腹腔, 手术切口约 2 cm , 轻轻拨开腹腔脏器, 暴露腹主动脉,采集血标本 4 m l , 立即全血离心 (4℃、 3 000 r/ min离心 15 m i n ) , 取上清液置于离心管 (Eppendorf , EP) 管中,置入 -80℃冰箱冷冻保存,比色法检测肠黏膜D- 乳酸及 DAO 水平, 具体操作方法严格参照试剂盒说明书进行。 游离小肠组织, 肉眼观察小肠组织特点,在距幽门 10 cm 处取 2 m m ×10 m m 的小肠组织, 40 g/ L 的中性甲醛溶液中固定, 经常规梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋, 切片, 苏木精 - 伊红染色法(hem at oxyl i n-eosi n st ai ni ng, H E) 染色处理后, 在光学显微镜下观察小肠黏膜形态结构变化。

统计学方法

采用 SPSS 19. 0 统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (x±s ) 表示, 多组间正态分布的计量资料比较用单因素方差分析 (One-way, ANO-VA) , LSD 进行组间均数的两两比较, P <0. 05 为差异有统计学意义