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使用离心机搭配进行蛋白超滤分离

见到论坛上很多做蛋白纯化的小伙伴,经常在使用超滤技术的时候遇到各种相同的问题,反复的在版块上出现,根据自己的经验,我把此方面的内容整理一下,便于初学者以及遇到问题的小伙伴了解掌握。


如果大家有问题可以留言,咱们切磋交流,我没有将我在使用中的经验、教训一一罗列,更多的是将该技术相关的基础知识和背景进行了总结,因为我认为我们对任何一种技术的研究运用,都应当立足于其基础知识和背景来进行,而非“明知不可而为之”。


超滤(此处仅指用于蛋白样品处理的超滤技术)


定义:是以压力为推动力进行大分子和小分子分离的膜分离技术之一。


关键概念:截留分子量(MWCO),所有的膜分离技术均涉及的问题。其定义为:用已知分子量的球状物质进行测定。膜对被截留物质的截留率大于90%时,就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能。以前参加研讨会的时候有老师称,一般大分子量90%截留,小分子量50%截留。与超滤有关的另一个概念是浓差极化,在膜分离过程中,大分子物质被膜所截留不断累积在膜表面上,使其在膜表面的浓度远高于其在主体溶液中的浓度,从而形成浓度差,并促使其反向主体溶液中扩散。一方面造成局部浓度过高,对蛋白本身的稳定性造成挑战,极易沉淀,另一方面对分离产生阻力,影响分离的成败和成本。


常见用途:去除盐类,浓缩样品


主要误区:经常有人认为或建议别人使用超滤技术进行两个不同大小分子量的蛋白分离,但几乎很少有人尝试成功过,即使成功了,也很难重复出来。仔细理解定义,我们可以看出超滤技术的局限性在哪里,关键词就在于:已知分子量的球状物质、截留率。这也是导致误区的所在。我们所拿到的标示10KD截留分子量的超滤装置,仅代表10KD球状蛋白可以很大概率的被截留在膜上面。定义中是进行的一个标准实验,实际使用中情况千差万别(我们的蛋白形状未必都是球状的,其他杂质存在干扰,膜及装置的差别等),所以不必太纠结这个MWCO的存在,参考而已。在使用时,一般会选择1/3目标蛋白分子量的超滤装置规格进行使用。以保证目标蛋白的浓缩。


常见超滤装置:

超滤是以压力为推动力的,常用的压力来源有使用惰性气体、离心力以及电驱动泵动力几种情况。我使用比较多的是下面的前两张图,左图是使用氮气罐进行正压超滤,可以进行搅拌,避免浓差极化,一般使用的压力为0.15-0.2MPa。过高的压力一方面超出装置的耐受,另一方面高压也容易引起蛋白质的失活变性。右图是不同规格的超滤管,搭配离心机进行使用,离心力一般几千g,不同厂家的有垂直的膜,也有水平的膜,我认为水平的效果稍好,使用这个装置的话,不可避免的损失比前者大(但其实每一种膜分离技术,损失都是不可避免的),我做过有时的损失会达到50%-70%,浓度越低损失越大。第三种是中空纤维浓缩,自动化程度可实现较高,处理样品的体积可以很大,可实现高倍浓缩,是其主要优势。


使用中常见注意事项:

超滤膜保存非常重要,不管使用哪一种装置,在使用后进行高盐+水清洗,以及低浓度乙醇保存,中空纤维的可以使用NaOH保存,尤其是前两种,膜一旦干了,就会导致孔径变化,或膜裂,无法继续使用;

不同蛋白最好不要混用超滤膜,非常容易引起交叉污染;

以上装置仅适用于澄清样品处理,浑浊样品会加剧膜孔径的堵塞和损坏;

使用过程中压力或离心力不要超出要求,以免损坏装饰;

一些超滤膜是分正反面的,即孔径分布呈梯度,也有一些超滤膜是不分正反面的,孔径均匀分布;

以上3种装置,我在使用中均遇到过蛋白沉淀的情况,因此蛋白质的稳定性问题需多考虑解决。


以上片段来自于丁香园,由英泰离心机整理发布。