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使用离心机进行体外分析亚洲玉米螟幼虫血细胞包囊的材料与方法

在很多行业中离心机都有应用,今天我们要介绍的是离心机在农业中的应用,我们可以对亚洲玉米螟幼虫的血细胞进行分离,制定害虫防范策略。

供试昆虫及饲养

 将亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫置于(25±1)℃,相对湿度>70%和光周期16L:8D的温室条件下,依Zhou et al(1979)方法,采用半人工饲料饲养。根据其头壳宽度和蜕皮次数来鉴别龄期。

亚洲玉米螟幼虫

血细胞的收集和分析

用解剖剪剪去亚洲玉米螟五龄第3天幼虫的第二腹足,将血淋巴液滴于Parafilm膜上,用移液器迅速将其移入装有1 mL预冷的生理盐水(Pringle’sSaline:1.541 mol/L NaCl,0.027 mol/L KCl,0.14mol/L CaCl2,0.222mol/L 葡萄糖)或抗凝剂(0.098mol/L NaOH,0.186mol/L NaCl,0.017mol/L EDTA,0.041 mol/L 柠檬酸,pH 4.5)的离心管中,4℃下500 g离心5 min。弃上清液,再加入1 mLPringle’sSaline重悬。重复离心后用适量Pringle’s Saline重悬待用。同时,每次取部分细胞悬液,使用血球记数板计算血细胞密度。

体外包囊方法

96孔板法 无菌条件下在 96 孔板每孔中加入 1%琼脂糖 70µL,待其凝固后加入一定密度的血细胞 50 µL 和 20~60 个葡聚糖凝胶珠 SephadexA-25。将孔板用 Parafilm 膜密封好后置于 26℃室温下培养,每隔规定时间在相差显微镜下观察包囊情况,或用移液器取出部分孔内的珠子统计包囊结果。

离心管法 无菌条件下取一定密度的 50 µL血细胞滴于 0.2mL 离心管中部使其形成悬滴,并加入 20~60 个葡聚糖凝胶珠 Sephadex A-25 于悬液中央。然后将离心管固定于匀速旋转(约 4r/min)的台式风扇的导风轮上,离心机管口部朝上,尾部指向风扇轴心。置于 26℃室温下,每隔规定时间用移液器取出部分离心管内的珠子观察统计包囊结果。

体外包囊程度的划分

根据包囊的厚度对包囊程度进行划分,每一类分别用渐次增加的数字代表:0表示没有血细胞黏附或只有数个血细胞黏附;1表示包囊厚度小于凝胶珠半径的1/2;2表示包囊厚度大于凝胶珠半径的1/2,小于半径;3表示包囊厚度大于凝胶珠半径。同样,根据包囊的面积对包囊程度也进行划分,每一类分别用渐次增加的数字代表:0表示没有血细胞黏附或只有数个血细胞黏附;1表示包囊面积小于凝胶珠表面的1/3;2表示包囊面积大于凝胶珠表面的1/3。对每一时间点不同程度的包囊分别进行加权,然后用它们的加权和代表在这一时间点时包囊的总体情况,即包囊程度。计算方法为:包囊程度=∑(P×T+P×A),其中P代表每一类珠子占总珠子数的百分比,T代表包囊厚度的数字类别(即0,1,2,3),A代表包囊面积的数字类别(即0,1,2)。

每一时间点的包囊比率为被包囊珠子占总珠子的比例。厚度大于凝胶珠半径的1/2,且面积大于凝胶珠面积的1/3的包囊看作为已包囊,其他为未包囊。

数据分析方法

为了避免昆虫血细胞在大密度条件下出现聚集,通常在收集血细胞时会使用抗凝剂。但是由于包囊反应的过程要求血细胞具有良好的聚集能力,因此是否抗凝剂处理后的血细胞可以用来进行包囊分析,目前还未见报道。我们比较了在收集血细胞时分别使用抗凝剂和Pringle’s Saline两种不同缓冲液的条件下,1×107cell/mL的血细胞对SephadexA-25在2h后的包囊情况,并对同一细胞密度时的两种处理的包囊百分比和包囊程度进行差异显著性分析。平均值的差异显著性分析方法采用独立样本t检验(t-test)。