中国一流的离心机生产企业
专注生物医疗、实验室离心机

高速离心机进行酵母细胞连续密度梯度分离的过程及方法

利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞,并在单细胞水平上,应用激光光镊拉曼光谱对分离的同步细胞进行鉴别。采用高速离心机角式转头和2mL聚丙烯离心管,20℃,19320g离心15min,将大约1.75mLPercoll溶液形成1.00~1.31g·mL-1连续密度梯度;将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层,20℃,400g离心60min,酵母分成明显的2层细胞带;微分干涉差显微镜(DIC)、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示,下层酵母细胞以单个细胞为主,大小均匀、致密,折光性强,生长呈现阶梯式增长,具有同步细胞生长的特性,确定其为同步的G0细胞。利用单细胞光镊拉曼光谱系统对所分离的G0同步细胞与非G0细胞进行分析,结果显示G0同步细胞和非G0细胞的特征峰位置基本一致,但G0细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G0细胞,说明G0细胞大分子物质含量要比非G0细胞的高;对G0细胞和非G0细胞进行主成分分析,结果显示,分离的同步化G0细胞之间成分含量差异少,比较均一,而非同步细胞之间内含物质差异大,呈不均一性,说明单细胞光镊拉曼光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞。改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,能够分离多数酵母菌株同步化细胞,是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法。

实验所用的离心机仪器与试剂

高速离心机,带角式转头(长沙英泰仪器有限公司),相差显微镜(德国Leica公司DM2000),紫外-可见光分光光度计(美国Beckman公司DU800),光镊拉曼光谱系统(LTRS,广西科学院生物物理实验室搭建)。Percoll(Sigma公司),Yeastextract(Oxoid公司),Pep-tone(广东环凯微生物科技有限公司),Tris(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2菌株和培养基

As2.1364,As2.400,CGMCC2.1822购于中国普通微生物菌种保藏中心;安琪酿酒高活性干酵母、梅山即发活性干酵母购于市场;S288C,ATTC24859,INVSc1,Hbv为广西科学院国家非粮生物质能源工程中心保藏。上述菌株分别标注为1~9号。YEPD培养基:2%蛋白胨,1%酵母膏,2%葡萄糖。

1.3细胞培养及分离

1.3.1酵母细胞稳定期培养物的制备

分别挑取1~9号酵母菌株单菌落,接种于YEPD培养基180r·min-1、28℃活化培养8h后,按1%接种量接到250mL新鲜YEPD培养基连续培养8天后,3000r·min-1离心3min,离心去掉YEPD培养基,用50mmol·L-1pH7.5Tris缓冲液漂洗三次,离心去上清液,沉淀物用Tris缓冲液悬浮(OD=200),4℃保存备用。

1.3.2Percoll密度梯度分离

参照Allen等的方法[10],用连续密度梯度离心分离细胞,但在仪器的使用上进行改良,即用角式转头替代超高速离心机的悬垂转头,15mLCorex管则用2mL离心管代替;在操作步骤和Percoll介质浓度上进行优化,具体步骤如下。

(1)Percoll等渗贮备液的配制

Percoll母液与1.5mol·L-1无菌NaCl溶液按9∶1配制成Percoll等渗贮备液。

(2)Percoll连续密度梯度的形成

在已灭菌的2mL聚丙烯离心管中加入Percoll等渗贮备液1.7mL,20℃、角式转头、19320g离心15min形成Percoll连续密度梯度(1.00~1.31g·mL-1)分离介质。

不同酵母菌株稳定期(sp)的培养物的细胞密度不同,离心分离过程中将在不同密度介质层上形成细胞带。但是,前期的实验中发现,如果只是以9∶1配制成Percoll等渗贮备液制备连续密度介质,不足以分离不同的菌株样品。以Per-coll等渗贮备液为100%,用50mmol·L-1pH7.5Tris缓冲液稀释成90%,80%,70%,60%,50%系列梯度Percoll溶液以作分离介质,然后依次测试不同样品。

(3)加样及细胞的分离

吸取制备好的细胞悬浮物100μL(OD=200),缓慢地均匀铺加在2mL离心管Percoll连续密度梯度液顶部,然后在25℃、400g离心60min使细胞分层。

(4)细胞的收集

从最下一条带的细胞层开始,在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带,用带20G针头的1mL注射器从离心管外壁稍低于细胞带的位置进行穿刺,小心抽吸细胞带,拔出针头,将含细胞的溶液转移至无菌的2mL离心管,酵母细胞加Tris缓冲液漂洗,3000r·min-1离心3min,去上清液,重复三次,加Tris缓冲液悬浮。

1.4 微分干涉差显微镜以及相差显微镜观察

利用微分干涉差显微镜(DIC)(100×)以及相差显微镜(phasecontrastmicroscope)(100×)对不同细胞带的细胞进行观察并拍照。

1.5 细胞同步生长培养

分别取同一样品不同层带的细胞,接入YEPD培养基中混匀,使两种细胞的终浓度处于同一数量级(OD600=0.07),并分装于250mL三角瓶中,培养8h,从接种时刻开始,每20min取样一次,每次取样三瓶;以未分离的细胞作对照,测定菌液OD600值,血球计数板计算细胞数。以各时间点菌液的细胞个数为纵坐标,以培养时间为横坐标,绘制细胞的生长曲线。

1.6同步细胞光镊拉曼光谱测定以及主成分分析(principalcomponentanalys,PCA)

1.6.1 光镊拉曼系统

光镊拉曼系统能在接近自然生理状态下研究单细胞,从拉曼光谱特征峰的位置、强度和线宽可以获得样品的分子组成及结构信息,从而实现实时观察单个细胞的生化组成、变化,判别不同类型、不同状态的细胞。系统如文献[11,12]所述。

1.6.2 光镊拉曼光谱的收集及数据处理

以15mW和780nm激光激发,拉曼信号收集时间30s,对Percoll分离获取的同步与非同步细胞各30个细胞收集拉曼光谱和5个背景光谱。用光谱仪自带软件WinSpec32将光谱数据转换为ASCII数据,输入软件Micro-Origin8.0处理。每个样品的5个背景光谱先五点平滑,后进行平均得到平均背景光谱,而各个样品中细胞的平均光谱是由样品内部每个细胞的光谱减去平均背景光谱后进行平均,后经五点平滑获得,此步工作使用自编的Matlab程序完成。应用软件TheUnscrambler9.7对其两种细胞的30个细胞的拉曼光谱600~1800cm-1指纹区集中的区域进行PCA分析,Micro-Origin8.0绘制PCA三维散点图。