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差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质进行受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质

建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白,且可鉴定蛋白质的方法,是目前开展蛋白质组学研究所面临的技术难题之一。双向凝胶电泳(2D—PAGE)和双向液相色谱分离(2D—LC)技术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术,但前者易受细胞组织内干扰物影响,例如核酸、多糖和脂类物质旧1;而后者在分离过程中,易丢失部分蛋白质,难获取全蛋白。目前,组织细胞全蛋白的常用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等。针对生物材料来源不同,优化提取组织细胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今,相关的研究已有大量且详细的研究报道,但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一,相关的研究仅仅处于起步阶段。环境蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物,在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的多种蛋白指示物,为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据。

本实验以牙鲆肝脏组织为材料,选用离心机进行差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术,差速离心法原理可以参考本站的资料。高效提取和优化分离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白,为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。

差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质原理过程

取实验组(受镉盐胁迫)5条牙鲆的肝脏(POL)各20 g,混合后共100 g。对照组的POL取法同上。加入等体积匀浆缓冲液,在冰浴条件下研磨制成匀浆。随后,使用离心机以400×g的相对离心力在离心10 min,去除未磨碎的组织和细胞,收集上清液I,备用。选用下列差速离心技术,分步收集蛋白沉淀物,并选用2D.PAGE进行有效分离,具体实验步骤(离心机腔内温度始终维持在4℃环境下,需要使用冷冻离心机进行):

(1)1000×g沉淀分离i以1000×g的相对离心力离心上清液I 10 rain,收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。该沉淀物主要是细胞核,用匀浆缓冲液洗涤两次,最后收集沉淀样品备用(一20℃保存,下同);

(2)12000×g沉淀的分离:以12000×g的相对离心力离心上清液Ⅱ30 min,收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。选用匀浆缓冲液洗涤该沉淀蛋白两次,最后收集沉淀样品备用;

(3)100000×g沉淀的分离:以100000×g的相对离心力离心上清液Ⅲ30 min,收集沉淀蛋白质和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多数蛋白是胞浆蛋白,收集样品,冻干备用;

(4)上述所有收集的蛋白组分分别充分溶解于裂解液中,并选用100000×g的相对离心力离心蛋白样品10 min,分别收集上清液,称为POL蛋白组分I(1000×g沉淀蛋白)、POL蛋白组分Ⅱ(12000×g沉淀蛋白)、POL蛋白组分Ⅲ(100000×g沉淀蛋白)和POL蛋白组分Ⅳ(胞浆蛋白),并用于双向电泳分离。