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超速离心机分析细胞样本的介绍

超离心机是研究高分子化合物如生物大分子蛋白质、核酸和病毒等的一个重要工具。在分析方面主要用以测定这些生物大分子的沉降系数与分子量。在制备方面可用以分离这些生物大分子和有关的亚细胞成分。在研究电离辐射对细胞原发损伤的规律时,观察射线对生物大分子的损伤和亚细胞成分的破坏,及其对生化功能的影响等问题,超离心机将是可供利用的研究工具之一。木文先简要地介绍超离心机的一般原理和应用范围,然后说明在研究放射损伤方面的一些实例。


为了研究胶体颗粒的理化特性,vSedber户〕(1940)设计制造了一种高速离心机,在离心过程中可以利用光学方法观察胶体颗粒的沉降行为。他称这种离心机为超离心机(ultraeentrifuge)以区别于其它离心机。以后又试用超离心机研究蛋白质的分子特性,表明某些分离的天然蛋白质是相当均一的,并利用超离心分析法测定了马血红蛋白的分子量。这些实验的成功,说明了超离心机是适于研究高分子化合物的一种很有用的研究工具。

超离心机的应用现已日趋普遍,例如在生物化学方面已广泛应用于蛋白质、酶、激素、核酸和病毒的研究〔,,,及医学诊断指标方面的应用`”。其主要用途为生物大分子和高聚化合物的分离及其沉降系数与分子量的测定,以及他们的缔合、离解和降解等研究;追随大分子的分离提纯过程,并鉴定其均一程度和组成等〔们。现在超离心机几乎是研究蛋白质和核酸所必备的重要仪器。由于多年来在各种不同条件下研究沉降现象的经验积累和广泛的理论探讨,对于超离心机实验结果的数理分析也日趋完善。


一般所指超离心分析法可分为两种类型,即沉降速度法与沉降平衡法7tJ。在沉降速度法实验中若转速达到50,00一60,00转/分,则在原来溶液中分布均一的高分子将以一定速度移向离心池底部。因此离心池顶部溶液山于溶质分子的离去,将产生仅有溶剂分子的上清液层。此上清液层以下浓度均一的溶液部分称为“坪区”。在上清液层与“坪区”之间有一过渡区域,在这区域内沉降物质的浓度随着与转轴中心的不同距离而变化,这个区域称为界面,沉降速度法主要是利用光学方法来测量这种界面的移动,也即是测量坪区溶质分子的移动。通常光学系统并不直接记录浓度,而是记录浓度的变化(相当于光折射率梯度的变化),这样所得的峰形谱线沉降图象,类似于界面电泳实验中所见到的峰形谱线电泳图象,一个峰形相当于溶液中一个沉降的溶质成分。


在沉降平衡法实验中,将超离心机维持在较低转速,例如以分子量为60,000的蛋白质分子进行沉降平衡实验时,仅需8000转/分。因此沉降分子循离心方向向离心池底部移动的速度很小,另一方面由于溶质分子的部分沉降产生浓度梯度而引起扩散,故两个相反方向移动的溶质分子的量,在适当时间可能相等而达到平衡状态。此时测定平衡时溶质分子的浓度分布,可以直接计算分子量,并不需要扩散系数,这与沉降速度法不同,但两者均需溶质分子的微分比容数据,此法的理论基础较好,但达到平衡的时间很长,有的实验需要数天,甚至更长的时间。这是缺点,故应用不普遍。