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酶标板转子低速离心细胞制片方法介绍和分析

将液体样本均匀地涂布在载玻片上,形成可以在显微镜下直接观察细胞形态和结构变化的细胞涂片,是常用的生物医学实验手段。从机体组织或培养的细胞到肉眼观察成像,整个操作过程需要良好的技术和丰富的经验。如果细胞涂片需要长期保存或其他进一步操作如细胞染色等,干燥固定是必不可少的处理措施,虽然已有商品化的专用细胞涂片离心机,但此技术在设备和方法上仍然存在着发展空间。普通离心机可以直接制备细胞涂片,贴壁培养大肠癌细胞株SW480细胞经离心机制片,保持了细胞贴壁生长的原来形状。

本文利用实验室常备的酶标板转子低速离心机,改良细胞制片技术。

1 材料和方法

1.1 材料

白血病T淋巴细胞株Jurkat为本实验室保存,小牛血清、RPMI1640培养液、载玻片、瑞氏-姬姆萨染色液;细胞涂片离心机,酶标板转子低速离心机。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

细胞株Jurkat培养于含10%小牛血清的RPMI1640(加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)细胞培养基中,换液培养瓶中约一半液体传代,加入相近量的细胞培养基,置于细胞培养箱中,待细胞培养室呈对数生长时备用。

1.2.2 细胞涂片制备与染色

收集上述细胞,800r/min离心5min,去上清液,加入PBS洗涤1次,然后调整细胞浓度为1×106mL,分别取等量的细胞进行3种方法制片。直接涂片法,取20μL细胞悬液均匀涂布载玻片,然后置于室温干燥;细胞涂片离心机法取等量的细胞,然后加200μL的PBS稀释,安装好载玻片加样500r/min离心3min;酶标板转子低速离心机法,先用透明胶带固定载玻片上下端在酶标板上,然后取20μL细胞悬液均匀涂布载玻片,立即置于酶标板转子上500r/min离心3min。离心后取出载玻片置于室温干燥,均加数滴甲醇固定,任其挥发干燥,然后瑞氏-姬姆萨染色,干燥后显微镜下观察,CCD拍照。

酶标板转子低速离心细胞制片方法

分析

如图所示3种方法制备的Jurkat细胞涂片,直接涂片法中制备的细胞涂片(A),细胞固缩,面积变小,染色深沉,细胞质核界限不清,难以看清细胞内部结构,整个图像效果差,达不到细胞制片要求。而细胞涂片离心机和酶标板转子低速离心机制备的细胞涂片(B、C),细胞均保持培养体系中原来大小,细胞核、质界限分明,细胞质蓝色,细胞核深紫,也可见分裂相细胞,整个图片清晰,经超过5张以上的细胞制片显微镜下观察,图像B、C均优于A,符合细胞片要求,且B、C细胞染色效果没有差异。第3种方法因直接涂片离心,不需要过多的前期准备及后期配件清洗,操作过程更为便捷。

现有的细胞涂片技术,较简单的方法是直接涂布于载玻片上,复杂方法需使用专用细胞涂片离心机,首先将载玻片置于该设备玻片匣里,垫一张自制带孔载玻片大小的滤纸,扣牢放入离心机转盘中,将处理好的细胞加入进样孔,以一定速度离心,取出载玻片,最后清洗设备玻片匣备用。直接涂布制片后染色,如图1A细胞变形、缩小,效果差。细胞涂片离心机制片效果如图1B,细胞保持原状,染色效果理想,符合生物医学制片要求,与培养体系中理想Jurkat细胞形态和结构保持一致。同样,图1C与图1B相同,与A差异大,说明制片C的酶标板转子低速离心机法,具有细胞涂片离心机相同的细胞制片效果。在制片原理上,用离心法脱去细胞周围的液体,防止自然干燥中水分挥发后电解质浓度升高,避免了细胞脱水而致使细胞固缩和染色效果不佳的情况。因此直接涂片细胞变小,而细胞内物质积聚,因此染色时与染料在单位体积内结合更多而着色深沉。酶标板转子低速离心机法与细胞涂片离心机原理一样,所以效果相同。并且此法仅仅是将载玻片用透明胶带固定在酶标板上,在原有的酶标板转子低速离心机中离心而已,离心机是生物学教学、科研领域中常见的仪器,并没有增加设备和耗材。而且整个过程不需要太多的前期准备工作和后期的清洗负担,也可用于其他来源的组织体液样本,尤其适合高校教学,培养大学生实践创新能力。此方法要求操作迅速,不同样本的离心速度和时间也不尽相同。总之,以保留细胞、快速干燥细胞外而不损失细胞内水分为准则。