中国一流的离心机生产企业
专注生物医疗、实验室离心机

通过离心机和梯度离心法提高外周血淋巴细胞梯度离心分离率

目前,在临床检测和科研实验中获取人外周血淋巴细胞最常用的技术仍是经典的外周血密度梯度离心法。此法操作简便、分离速度快,也毋需特殊的设备,因此适用于各类实验室,尤其是基层实验室。然而,用该法所获得的淋巴细胞分离率,往往各家不一,效果也不尽如人意。笔者通过多年的摸索,寻求出提高淋巴细胞分离率的一些技巧和方法,现介绍如下。


梯度离心法的实验原理

人外周血淋巴细胞Ficoll_泛影葡胺密度梯度分离液是由具有粘性的低浓度Ficoll(葡聚糖)和高浓度物质泛影葡胺,按一定比例配制成比重为1.077±0.002的液体。其原理是以不同细胞有不同的沉降速度这一特性为基本依据,而细胞的沉降速度又取决于细胞的体积、形态和比重,细胞凝聚后可因体积增大使沉降速度加快。当全血标本置于淋巴细胞分离液上离心时,红细胞因比重最大(1.092)并在Ficoll作用下凝聚成团首先下降,粒细胞也因体积和比重(1.090)较大且有凝聚倾向,与红细胞同沉于管底;淋巴细胞则因比重(1.070)小于分离液而离开血浆悬浮于分离液上。与淋巴细胞同时悬浮的还有单核细胞,但由于单核细胞数量甚少,又具有粘附性,易与淋巴细胞分离,因此单核细胞悬液一般也可作为淋巴细胞悬液。若需要更高纯度的淋巴细胞,则可用凝胶过滤法、尼龙毛分离法等吸附单核细胞的方法,去除单核细胞,获得进一步纯化的淋巴细胞。此外,细胞的沉降速度还与离心力、离心速度和一些分离的实验条件有关。

梯度离心法原理:http://www.ytyq.com/jishu/813.html


不同实验条件下的淋巴细胞分离率

鉴于细胞的分离取决于细胞的沉降速度,而后者除了决定于细胞本身的条件外,还与实验条件相关。因而为了提高外周血淋巴细胞的分离率,就必须从实验条件着手。结果表明,在各实验步骤中单独改变其中的某一条件,分离获取的外周血淋巴细胞的数量及存活率便相应有所改变(表1)。

从表1可以看出,采用不同的实验条件,可以分离到数量不等的淋巴细胞,有时甚至差别很大。


技巧及注意事项

1 存放血样的容器最好选用带有盖子的试管

采血后试管应缓慢上下倾斜4~5次,使血液既能与抗凝剂充分结合,又避免因剧烈晃动而引起溶血。如无带盖子的试管,则不如采用10mL锥形瓶。使用普通试管采集抗凝血,经常会出现抗凝不完全或溶血的现象(特别是在采血量较多时),从而影响淋巴细胞的分离。


2 分离淋巴细胞的离心管以小管径为佳

由于离心后淋巴细胞层只是一薄层,管径小则其细胞层相对较厚,便于吸取淋巴细胞。反之,管径大淋巴细胞层则较薄,吸取细胞时就容易吸到其上层的血浆或其下的分离液。


3 稀释血样加到淋巴细胞分离液上时,须沿管壁缓慢加入

开始加血样到分离液上面时,要缓慢加入,待血样在分离液表面形成一完整的层面时,速度可适当加快,最终在分离液的上面形成一层边界清楚的稀释血样层(图1_A)。如开始时速度太快,血样可能会在分离液处形成一隧道,造成部分

淋巴细胞随红细胞直接沉入管底。


4 离心的转速应根据不同离心机而定,时间随室温不同而相应改变

不同的离心机,具有不同的离心半径,其转速虽相同,但相对离心力却可以相差很多[相对离心力(g)=1.18×10-5×有效半径(cm)×(每分钟转速)2]。

部分进口的离心机,可直接显示相对离心力或每分钟转速,使用比较方便;但大多数的国产离心机,一般均显示每分钟转速,故应根据相对离心力和每分钟转速的关系推算出应有的转速。本方法相对离心力为(573~708)×g,如离心机半径=15cm,则转速为1800~2000r/min;当离心机半径=12cm,则转速为2000~2200r/min。另外,离心时间也不是固定不变的,室温(22±2)℃时为20min,当室温过低时应适当延长,室温过高时则相对缩短。如果离心的速度和时间恰当,则可以看到液面呈现界限清楚的四层,且上三层无红细胞混杂(图1_B)。如离心速度太慢或时间不足,则淋巴细胞层较薄且在其上面可能有红细胞混杂(图1_C);反之如离心速度太快或时间过长,则造成淋巴细胞层过于分散(图1_D)。

离心前后的血细胞分布(A为离心前,B、C、D为离心后)

图1离心前后的血细胞分布(A为离心前,B、C、D为离心后)


5 吸取淋巴细胞时最好使用小注射针头抗凝

血经分离液离心后,可见离心管内分为四层(图1_B),自上而下:第一层淡黄色为血浆层;第二层很薄,呈白雾状或白絮状为淋巴细胞层,第三层无色透明为分离液层;第四层深红色沉淀物为红细胞层,粒细胞呈薄雾状附于红细胞表面。由于淋巴细胞层很薄,宜采用小注射针头(如1mL)吸取,并边吸边转动试管,这样既能将淋巴细胞完全吸干净,又不致吸进太多的血浆或分离液。而采用开口过大的注射器或玻璃滴管,均容易吸进过多相邻层面的液体,影响取材效果。若离心时因转速或时间调节不当造成淋巴细胞层分散,补救的方法是把淋巴细胞所在层面的液体一同吸干,并在后面的步骤中多做一次洗涤,便可避免丢失过多的淋巴细胞;若混杂有较多红细胞,最好再做一次分离。


6 在能沉淀细胞的前提下,采用最小的洗涤转速和最短的洗涤时间

洗涤的目的在于洗去对淋巴细胞有影响的分离液中的物质,若转速过高或时间过长反而对淋巴细胞造成机械性损伤。


综上所述,采用带盖试管储存抗凝血,小口径(9mm)离心管,台式水平离心机(r=15cm,22℃1900r/min,离心20min);1mL注射器吸取淋巴细胞,1600r/min及1500r/min各洗涤10min,是较好的组合。采血3mL,可分离淋巴细胞6×106个以上,存活率>95%。基本上达到少采血,多分离淋巴细胞的目的。如条件许可,最佳的采血容器是真空采血系统,既保证采集血样能与抗凝剂充分混匀,在很大程度上又可减少溶血的可能。