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使用离心机进行成年大鼠心肌细胞分离方法的改良

时间:2016-12-13 22:37来源:未知 作者:英泰仪器 点击:
目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究。 目的: 建立稳定的改

目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究。

目的:建立稳定的改良成年 SD 大鼠心肌细胞分离方法,使之适于进行原代培养和研究。

方法:SD 大鼠麻醉后,快速取出心脏,采用改良的 Langendorff 灌流装置行主动脉逆行灌注,无钙 Krebs-Henseleit 缓冲液(KH 液)非循环灌流 4 min,0.6 g/LWorthington 2 型胶原酶联合 0.03 g/L 蛋白酶消化约 15 min,剪下心室组织于消化液和10 g/L 牛血清白蛋白的混合液中,剪碎后于 37 ℃振摇孵育 10 min,200 μm 尼龙网过滤,500g 离心机离心 1 min,梯度复钙,自然沉降。

主要观察指标:心肌细胞的形态、活力和产量。

改进后的 Langendorff 灌流系统

图 1 改进后的 Langendorff 灌流系统

系统准备:准备好所有与实验有关的仪器和器械,将改进后的Langendorff 灌流系统置于超净台内,见图1。

37 ℃预热灌流系统,体积分数为70%乙醇灌洗15 min,然后用无菌去离子水清洗10 min,每次实验结束后也应用体积分数为70%的乙醇和去离子水清洗系统,确保其洁净。实验开始前所有灌流液首先氧饱和30 min。在动物麻醉开始前5 min加入无钙KH液循环灌流,调整流速为3 mL/min,同时用100% O2继续饱和,注意排空气泡。

心脏获取:实验大鼠在麻醉前20 min予以腹腔注射肝素1 000 U/kg,麻醉采用3 g/L戊巴比妥钠腹腔注射,剂量为20 mL/kg。麻醉成功后迅速开胸暴露心脏,自主动脉根部约5 mm处剪断后将心脏置于预冷的4 ℃无钙KH液中,可见心脏自主搏动数次排出心腔内血液。适当去除周围组织后迅速暴露主动脉并将其逆行插入灌流套管,动脉夹固定后再用丝线在其下方结扎固定。

分离方法:调整流速为6 mL/min,无钙KH液非循环灌流4 min。换用含有50 μmol/L CaCl2的酶液消化约15 min,流速8 mL/min,待到心脏外观发白、肿大并塌陷时剪下心室组织于相同的消化液和10 g/L牛血清白蛋白的混合液中,用眼科剪将其剪碎成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块,吸管轻轻吹打后于37 ℃振摇孵育10 min。200 μm尼龙网过滤,放入离心机中使用500g进行离心1 min,去除上清液,沉淀依次用含有200,500 mmol/L和1 mmol/L CaCl2的梯度复钙液复钙,每次复钙后自然沉降10 min,小心去除上清后再次行梯度复钙。复钙完成后用含有牛血清白蛋白、肌酸、牛磺酸、肉毒碱、胰岛素等添加物的M199培养基按照文献报道的方法进行无血清原代培养[13-15]。

主要观察指标:

①分离的成年大鼠心肌细胞的形态学观察。

②心肌细胞的活力检测。

③心肌细胞的产量。

设计、实施、评估者:实验设计为第四、五作者,实验实施为第一、二、三作者,实验评估为全体作者,所有参与实验者均经过系统培训,实验过程中未使用盲法评估。

分离即刻的心肌细胞,倒置显微镜下观察可见约90%的细胞呈长杆状,为存活细胞。少数细胞皱缩成圆形或椭圆形,为死细胞。复钙后,约3/4的心肌细胞维持杆状形态,胞膜完整,纹理清晰,其中约10%的细胞发生自发性收缩,其余细胞呈静息状态,为钙耐受细胞。

梯度复钙后的成年大鼠心肌细胞

梯度复钙后的成年大鼠心肌细胞

改良结果

细胞活力检测 复钙后的细胞经锥虫蓝染色检测,(73±5.6)%(n=30)为拒染的活性细胞,其余细胞为蓝染的死细胞。

心肌细胞产量 30只成年SD大鼠的心肌分离结果显示,平均每个心脏的存活心肌细胞产量为(4.2±0.4)×10^6,无血清培养可生长7 d以上。


(责任编辑:英泰仪器)
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