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使用离心机通过区带离心法纯化地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗

应用区带离心法纯化原代地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗。方法浓缩的原代地鼠肾细胞乙脑灭活疫苗,经36%和60%不连续蔗糖密度、23000r/min离心4h后,收取纯化的乙脑抗原组分,制成纯化乙脑疫苗。结果浓缩疫苗经一步区带离心纯化后,抗原效价提高3倍以上,蛋白去除9.5%以上。经稀释制成的半成品疫苗与未经浓缩的原疫苗相比,抗原效价提高4倍以上,蛋白去除9%以上。结论区带离心法可用于纯化地鼠肾细胞乙脑疫苗。


地鼠肾细胞乙型脑炎(简称乙脑)疫苗在降低乙脑发病率上起了非常重要的作用川。但是,由于抗原含量较低,抗体阳转率不理想图,需要反复加强注射,而且注射后副反应也较多[s],制备纯化的乙脑疫苗是解决以上问题的理想办法。VeID细胞乙脑疫苗采用蔗糖密度梯度区带离心法已取得很好的效果川,地鼠肾细胞乙脑疫苗的纯化是否也可以采用该方法,本文介绍初步研究结果。


1.疫苗

用15L转瓶培养原代地鼠肾细胞,按2000年版《中国生物制品规程》方法制备乙脑灭活疫苗,经20倍浓缩后用于试验研究。

2.离心机及离心方法

超速离心机,区带转头。蔗糖不连续梯度(30%至60%),23000r/min离心4h,收取纯化抗原组分制备纯化乙脑疫苗。

3.检测方法

采用助叨厂法检测蛋白含量;ELISA双抗夹心法检测乙肝抗原;反向间接血凝试验法检测残余牛血清蛋白;


区带离心图谱

经超速离心后,等量收取组分,分别检测各组分的抗原含量、蛋白含量并进行蔗糖密度梯度离心,见图1。由图1可看出杂蛋白峰和抗原活性峰明显分开,杂蛋白峰内只有很微量的抗原存在,抗原峰的蔗糖密度范围在32.5%一37%,峰值在34.5%。

蔗糖密度梯度离心图谱

应用蔗糖密度梯度区带离心法纯化V二细胞乙脑疫苗已经取得新药证书和试生产文号,在我国部分地区使用效果良好。将此方法用于地鼠肾细胞乙脑疫苗的纯化,也取得了满意的结果,约8-10d原疫苗可制备1耐纯化疫苗,不仅可以解决原地鼠肾细胞乙脑原疫苗的抗原不足、免疫效果不理想的问题,也可以解决杂蛋白过多、副反应较强的问题,从而提高了疫苗的质量。

层析法已广泛用于蛋白质的提取和疫苗的纯化,此方法较区带离心法简单易于操作,但是,乙脑疫苗经二步层析法也不能达到一步区带离心法所达到的纯度。区带离心法虽然设备较为昂贵,操作较繁琐,但是经过训练有素的技术人员操作,可以做到一步操作,产量较大,质量稳定,仍不失为一个较好的方法。

原代地鼠肾细胞乙脑疫苗的纯化,不需要象传代细胞那样去除细胞残余DNA,一步区带离心即可达到满意的纯度,使疫苗的纯化工艺更为简单方便。