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毛细管超速离心技术在分离混合视野红细胞的应用研究

毛细管超速离心技术在临床实验室中大多被应用于红细胞压积的检测,是实验室中红细胞压积检测的“金标准”,但该技术同样可以应用在临床输血实验室中,该方法可以有效分离患者自身细胞和新近输入的献血员细胞,大大方便了大量输血后患者红细胞血型的准确定型和临床输血不良反应的回顾性调查,现就该技术的细胞分离效果进行了实验室内模拟研究,结果报告如下。
 

 
微量血液离心机和毛细离心管为上海手术器械厂产品,抗 A、抗 B 单克隆抗体为上海血液医药公司产品,新鲜 A 型血液 5 m L、离体 7 d 和 14 d 的陈旧性 B 型血液各 5 m L,均来自上海市血液中心的献血员留样标本。
 
标准混合视野的制备方法:取 A 型压积红细胞 30 μL 加入适量 0.9%氯化钠注射液,洗涤 3 次后制成 3%的 A 型红细胞悬液约 2 m L,标记 Ac。取 7 d 前送检的 B 型压积红细胞10 μL 加入适量 0.9%氯化钠注射液,洗涤 3 次后制成 3%的B 型红细胞悬液约 0.6 m L,标记 Bc。按表 1 所示配制一系列标准的混合视野。
 
模拟混合视野标本的制备方法:取新鲜的 A 细胞和离体7 d、14 d 的陈旧 B 细胞分别用 0.9%氯化钠注射液洗涤 3 次形成压积红细胞,然后再加入 AB 型血浆制备成压积约为80%的压积红细胞。离体 7 d、14 d 的陈旧红细胞分别标注为B1、B2,然后按表 2 方法在新鲜 A 细胞中混入一定比例的 B细胞。
 
模拟混合视野标本的制备方法:取新鲜的 A 细胞和离体7 d、14 d 的陈旧 B 细胞分别用 0.9%氯化钠注射液洗涤 3 次形成压积红细胞,然后再加入 AB 型血浆制备成压积约为80%的压积红细胞。离体 7 d、14 d 的陈旧红细胞分别标注为B1、B2,然后按表 2 方法在新鲜 A 细胞中混入一定比例的 B细胞。
 
用毛细离心管对表 2 中的 4 个标本进行超速离心分离:表 2 所示的 4 个标本分别利用虹吸现象吸入毛细离心管中,底部用橡皮泥封堵后进行毛细管超速离心 11 000 r/min×5 min,然后分别把远、近心端的细胞制成 3%的红细胞悬液,以观察超速离心后远、近心端细胞的混合视野的变化,并与一系列标准管内混合视野内细胞扣的大小相比较,进而判断超速离心法对新、旧细胞的分离能力,实验重复 3 次取均值。1.2.4 观察方法:对于标准混合视野管,每管取出 50 μL 红细胞悬液,各加 50 μL 抗 B 抗体,混匀后 3 次离心后(3 400 r/min×15 s),观察各个试管中凝集细胞扣的大小;对于人工模拟混合视野标本的 1~4 号管经超速离心分离(11 000 r/min×5 min)后的远、近心端细胞分别制成 3%的红细胞悬液,再分别取 50 μL 红细胞悬液,各加 50 μL 抗 B 抗体,混匀后 3 次离心后(3 400 r/min×15 s),观察各个试管中凝集细胞扣的大小并与标准混合视野管的凝集细胞扣进行比较,从而判断超速离心后远、近心端 B 细胞所占的比例。
 
远心端的 B 细胞比例与样本混入 B 细胞的比例相比较以及不同离体时间 B 细胞分离后远心端 B 细胞比例的比较均采用 SPSS 17.0 的 2 个独立样本非参数 Mann-Whitney U 检验进行观察,以 P<0.05 为差异有统计学意义。
 
超速离心法对混合视野标本的分离结果:超速离心后模拟混合视野的的标本(编号为 1~4 号)分别经超速离心分离,远、近心端的混合视野的凝集细胞扣与标准凝集管相比较(见表 3),结果表明经过超速离心后 2 种混入 B 细胞比例的样本远心端 B 细胞所占比例均明显高于未经离心时 B 细胞所占比例(Z=-2.121,P=0.034),可见超速离心技术能够把新、旧细胞进行有效分离,新鲜细胞在近心端分布,陈旧 B 细胞被离心至远心端;离体不同时间的 B 细胞经超速离心处理后 B 细胞在远心端所占比例差异均无统计学意义(Z=-1.826,P=0.068),B 细胞在远心端的比例约为未经离心处理时的2 倍。
 
离心技术是根据细胞的密度差和沉降速度差进行分离,细胞在液体介质中的沉降速度取决于细胞的大小和密度,也受悬浮介质的密度、黏度、渗透压和力场大小所影响。该技术常被用于红细胞压积的检测,是临床实验室中红细胞压积检测的参考方法,国内有学者利用该技术来检测血清中的高、低密度脂蛋白和脂蛋白(a)胆固醇的浓度[1-4],以及通过超速离心来提高血站系统 NAT(nucleic acid amplificationtechnique)筛查的不确定标本的鉴别率[5,6],而应用该技术来进行混合视野红细胞的分离在国内报道尚属首次。