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离心机进行人精细胞基因组DNA的分离提纯方法及其含量测定

近年来分子生物学的进展迅速,在20世纪90年代深感人类遗传及生殖上许多问题有必要从分子生物学的观点与方法上来解决,如男性不明原因不育症及某些无法解释的遗传疾病,若能从分子生物学角度去观察分析精子DNA的质和量,则将会对问题有所裨益。但是虽然早就有人从低等脊椎动物、哺乳动物的一些细胞,甚至鱼的精子中分离到DNA,而从哺乳动物精细胞分离提纯DNA则不容易,特别是从人精子中分离提纯DNA则极为困难,其原因是人精子头上有一层含硫丰富、能抗蛋白酶作用的类角质蛋白外衣包绕很难打破,药物又不能渗入。其次是即使已打破,这些动物的精子DNA牢固地与蛋白质结合着,甚至用1.ONNaOH处理也难分开,60及70年代的科学家对这些问题作了不少工作,但都未获理想的解决办法,直至80年代由于分子生物学技术的发展才有了较好的解决办法。1988年BahnakBR等提出了一个有效的方法图,但方法中必须使用超速离心机及一些昂贵的试剂,在没有这些条件的地方,特别是发展中国家仍无法引用,由于我们科研工作的迫切需要,自己试建不用离心机及昂贵试剂的方法。经过不断摸索,突破了精子头难破及破后DNA被大量蛋白质紧密缠绕很难分离的双重困难,建立了以下方法,并对人精子基因组DNA作了含量测定。
 
人精细胞基因组DNA
人精细胞基因组DNA
建立本方法时的要点
1、关于精子的洗涤
这一步骤是能否较易分离到精子DNA的重要步骤,由于精浆中含不少的DNAase及大量的蛋白质,故洗涤液中一定要含有EDTA才能更好地消除DNAase的作用,为了更好地除去蛋白质则必须洗三次以上,否则造成以后的分离困难,但这就又必须注意在洗涤中勿使精子过多地损失。
2、精子的裂解
Bhaank介绍的精子裂解液,加有昂贵且国内难找到的Sarkosyi试剂,我们探索使用了离液序列高的试剂—盐酸肌,加一定表面活性剂NP一40以代替aSrkosyl及能破坏蛋白质中双硫键的试剂硫基乙醇,结果精子裂解良好,但盆酸肌的浓度到底用多大,各资料不一致,经过用SM.6M及通M的盐酸肛对比实验,我们最终采用了4M并在37`C水浴保温,直至溶液透清,见不到精子颗粒为止。
3、用RNAase除去RNA的问题
据文献记载在生精过程中RNA逐渐消失。Abra-ham等也指出成年水牛精子中RNA的含量最多,但也只是总精细胞DNA的0.2%川,我们在实验过程中也未见到RNA的存在,与文献记载符合,故我们认为分离DNA过程中下必加RNAase来除去RNA。
4、关于沉淀精子DNA及对蛋白质的消化
精子DNA在初步用冷乙醇沉淀出来时,被大量的蛋白质包裹,必须设法将此蛋白移去,才能暴露出DNA,我们采用的办法是既加蛋白酶K消化此包裹蛋白,又加ssD使它与蛋白结合而游离出DNA,我们在实验观察中见到,在加TE溶解DNA前不能将初步沉淀的DNA抽得太干,否则将造成加sDS及蛋自酶K也极不易使之溶解,另外sDs的终浓度只能加到0.5%,否则反而不利于蛋白质的消化,因为蛋白酶K的活性在0.5%,发挥较好。
5、关于精子DNA的分离纯化
与一般DNA的分离纯化过程大致相同,采取酚氯仿硬氯仿(含异戊醇)抽提,但蛋白质较难除尽,为此必须灵活掌握抽提次数,务使水相较为清彻后才能取出水相,用冷乙醇沉淀DNA,否则将造成沉淀出的DNA尚夹杂不少蛋白质,影响纯化程度,从而影响其溶于TE。
6、本方法在实际应用中的意义
本方法可为尚不具备冷冻离心机的实验室提供解决人精子DNA分离提纯的问题,亦为确诊某些男性不孕症是否为精子DNA异常或其他有关问题提供一种途径。