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离心方法之等密度梯度离心法(等梯度离心法原理图)

等密度梯度离心也称为平衡密度梯度离心。等密度梯度离心是根据样品中各组分的浮力密度差不同进行分离。在离心立场中,溶液中颗粒浮力密度小则上浮,浮力密度 大则下沉,上浮和下沉的颗粒会一直延梯度液移动到与其浮力密度恰好相等的位置上,该位置也称颗粒的等密度点,离心时样品各组分颗粒将按其密度大小分别移至 等密度点形成区带,形成的区带不会因离心时间长而发生变化。离心后收集所需区带颗粒即为纯化组分。离心前后样品的状态如下图所示。
等密度区带离心原理图
等密度区带离心
因此,在离心前,样品可置于梯度液的任意位置,一般是均匀分布在梯度液中。等密度区带离心法的离心效果取决于样品颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效果越显著,与样品颗粒的大小与现状无关。
 
速率区带离心和等密度区带离心都需预准备梯度液。速率区带离心的梯度液密度必须小于待分离组分中最小颗粒的浮力密度。利用颗粒形状和大小差异而形成的沉降速 率不同达到分离目的。等密度区带离心是一种平衡离心方法,利用颗粒密度差进行分离,与颗粒形状和大小无关,处理量比差速离心法大。
 
等密度梯度离心经常使用的梯度液包括氯化铯(CsCI)、溴化钠等,典型的应用包括质粒DNA(或者其他DNA、RNA核酸片段)的大规模高纯度纯化,脂蛋白的分离纯化等。
 
质粒DNA的氯化铯等密度梯度离心分离纯化流程如下:
脂蛋白溴化钠等密度梯度离心分离纯化流程
脂蛋白溴化钠等密度梯度离心分离纯化流程如下:
1)人全血1000 g离心10分钟去除各种血细胞,上清为血清。
2)血清加入NaBr密度梯度液(不连续梯度)的底部,往上依次铺浓度变小的梯度液。
3)然后在水平转头中,260,000 g离心力14℃下离心24小时,各种密度的脂蛋白从管底浮向它们自己的等密度区形成了纯的各种密度脂蛋白区。而离心管底部保留着各种血清蛋白。
4)用上排法从离心管中抽出格层液体,经DU核酸蛋白分析仪测定,定位各种不同密度血清脂蛋白。