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使用冷冻离心机常用的细胞凋亡检测方法

 

在实验中经常需要检测细胞的凋亡情况,这里总结了几种常见的凋亡检测方法,希望能够帮到你。

一:细胞凋亡的形态学检测

 

 

发生凋亡的细胞在形态上有一定的特征。

 

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光学显微镜和倒置显微镜

 

未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

 

染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

 

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荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

 

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

 

常用的 DNA 特异性染料有:HO 33342(Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的,主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

 

Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度,使用时用 PBS 稀释,终浓度为 10 μg/ml。

 

DAPI 为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度,使用终浓度一般为 10 μg/ml。

 

结果评判

 

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ 期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图 1)。

 

 

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透射电子显微镜观察

 

结果评判

 

凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构;Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图 2)。

 

二:Annexin V 法

 

 

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图 3)。Annexin-V 是一种分子量为 35~36 KD 的 Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素(FITC、PE)或 biotin 标记,以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

 

 

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

 

方法

 

悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用 PBS 洗 2 次,加入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V(20 μg/ml)10 μl,室温避光 30 min,再加入 PI(50 μg/ml)5 μl,避光反应 5 min 后,加入 400 μl Binding Buffer,立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测(一般不超过 1 h), 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性对照。

 

贴壁培养的细胞染色:先用 0.25% 的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

 

爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

 

结果 

 


 

注意事项

 

1. 整个操作动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞。

 

2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。

三:线粒体膜势能的检测

 

 

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位(Δψm)的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA 断裂)出现之前,一旦线粒体跨膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转。

 

线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide(DiOC6)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC-1)、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

 

方法

 

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为 Rhodamine 123(1 mM)或终浓度为 DiOC6(25 nM),JC-1(1 mM),TMRM(100 nM),37 °C 平衡 30 min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。

 

注意事项

 

1. 始终保持平衡染液中 pH 值的一致性,因为 pH 值的变化将影响膜电位。

 

2. 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。

四:DNA 片段化检测

 

 

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处断裂,形成 50~300 kbp 长的 DNA 大片段,或 180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱 (DNA ladder)。

 

细胞经处理后,采用常规方法分离提纯 DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯 DNA 后,用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)标记 DNA,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。

 

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大分子染色体 DNA 片段的测定

 

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为 50~300 kbp 长的 DNA 大片段。所有超过一定分子量大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分 DNA,DNA 像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为「爬行。因此,细胞凋亡早期产生的 50~300 kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。

 

通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的 DNA 分子便滞留在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA 分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA 就可以按其分子量大小分开。

 

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DNA Ladder 测定

 

方法

 

收获细胞(1×107)沉淀→细胞裂解液→13 000 rpm ×5 min→收集上清,加 1% SDS 和 RnaseA(5 mg/ml)56 °C,孵育 2 h→蛋白酶 K(2.5 mg/ml)37 °C,2 h→1/10 体积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍体积的冷无水乙醇沉淀 DNA,4 °C 过夜→14 000 rpm×15 min→最后将沉淀溶解在 TE buffer 中,加 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色并照相。

 

结果

 

 

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凋亡细胞 DNA 含量的流式细胞计分析

 

方法

 

收集细胞→70% 冷乙醇(PBS 稀释)4 °C 固定过夜→PBS 洗涤,1 000 rpm × 10 min→RNase A(0.5 mg/ml)37 °C 消化 30 min→PI(50 mg/ml)染色,室温避光 15 min→FACScan 分析 DNA 亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

 

结果

 

 

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ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

 

优点:敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

五:TUNEL 法

 

 

细胞凋亡中,染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

 

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有 3'-OH 形成,很少能够被染色。TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六:Caspase-3 活性的检测

 

 

Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中 Caspase-3 为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原(32 KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的 Caspase-3 由两个大亚基(17 KD)和两个小亚基(12 KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,Caspase-3 的活性明显下降。

 

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Western blot

 

分析 Procaspase-3 的活化,以及活化的 Caspase-3 及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等的裂解。

 

方法

 

收集细胞→PBS 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 电泳→硝酸纤维素膜或 PVDF 膜转移→5% 脱脂奶粉封闭,室温 1.5~2 h 或 4 °C 过夜→Caspase-3 多抗或单抗室温反应 1~2 h 或 4 °C 过夜→TBS-T(含 0.05% Tween 20 的 TBS)洗 3 次,5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠 IgG 或 AP 标记的羊抗鼠 IgG 室温反应 1~2 h→ TBS-T 洗 3 次, 5~10 min/次→ECL 显影或 NBT/BCIP 显色。

 

结果

 

 

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荧光分光光度计分析

 

活化的 Caspase-3 能够特异切割 D1E2V3D4-X 底物,水解 D4-X 肽键。根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC 不能被激发荧光,短肽被水解后释放出 AMC,自由的 AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的 AMC 荧光强度的大小,可以测定 Caspase-3 的活性,从而反映 Caspase-3 被活化的程度。

 

方法

 

收获细胞正常或凋亡细胞→PBS 洗涤→制备细胞裂解液→加 Ac-DEVD-AMC(caspase-3 四肽荧光底物)→37 °C 反应 1 h→荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长 380 nm,发射光波长为 430~460 nm)。

 

结果

 

 

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流式细胞术分析

 

方法

 

收获细胞正常或凋亡细胞→PBS 洗涤→加 Ac-DEVD-AMC→37 °C 反应 1 h→UV 流式细胞计分析 Caspase-3 阳性细胞数和平均荧光强度。

 

结果

 

七:TFAR19 蛋白表达和细胞定位分析

 

 

TFAR19(PDCD5)是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因,前期的功能研究表明,它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素(FITC)标记的 TFAR19 单克隆抗体为探针,对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现,凋亡早期 TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学的变化,持续较长时间,在凋亡小体中仍然可见。

 

同时我们发现,凋亡早期 TFAR19 蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核 DNA 的片段化,提示 TFAR19 蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明,凋亡早期 TFAR19 的核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现 TFAR19 高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件,提供了一种新的技术和指标。

 

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TFAR19 蛋白的细胞定位分析

 

材料试剂

 

FITC 标记的单克隆抗体,pH 7.4 、0.15 mol/L PBS,3% 的多聚甲醛,PBS-T(pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 0.2% Tween 20),胎牛血清,荧光细胞洗液(pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 2% 胎牛血清及 0.1% NaN3),FACS 管,Tip 头,移液器。

 

仪器

 

冷冻离心机,37 °C 水浴箱,荧光显微镜,共聚焦激光扫描显微镜,流式细胞仪。

 

方法

 

1.悬浮细胞的染色

 

(1)收获正常和诱导凋亡的细胞(0.5~1×106),PBS 洗 2 次,1 000 rpm转速下离心机离心10 min。

 

(2)3% 多聚甲醛冰浴 10 min,PBS 洗 2 次,1 000 rpm离心机离心10 min。

 

(3)加入 PBS-T 溶液,37 °C 孵育 15 min,PBS 洗 2 次,1 000 rpm分离10 min。

 

(4)加入 200 ml 胎牛血清,室温反应 30 min。

 

(5)加入 5 ml FITC 标记的 TFAR19 单抗(终浓度为 1:40),4 °C 反应 30 min。

 

(6)荧光细胞洗液洗 2 次,1 000 rpm离心10 min。

 

将细胞沉淀滴片,荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察 TFAR19 在细胞中的定位。同时用流式细胞仪定量检测 TFAR19 蛋白的平均荧光强度。

 

 

2. 贴壁细胞的原位染色

 

(1)贴壁生长的对数期细胞铺在 24 孔或 6 孔板中(内有洁净盖玻片),让其爬片生长,待长到 50%~80 %满时,凋亡诱导剂处理细胞。

  

(2)将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色,染色步骤同上。

  

(3)将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5 ml)的载玻片上,荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察 TFAR19 在细胞中的定位。

 

 

3.临床病理切片的染色、检测

 

4.原代细胞的培养、检测

 

5.分析 TFAR19 蛋白在人体内各组织器官的分布及定位

 

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TFAR19 蛋白的表达与临床疾病

 

ELISA 法检测正常人和疾病状态下,以及疾病的不同时期,血清中 TFAR19 蛋白水平及其 TFAR19 自身抗体水平。

  

材料和试剂

 

1. 包被 BufferpH 9.6, 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

 

2. 洗涤液: pH 7.4,0.15 mol/L PBS 含 0.05% Tween 20

 

3. 封闭液: 3% BSA(用洗涤液配制)

 

4. 酶标抗体的稀释:用封闭液稀释

 

5. OPD 底物 Buffer:Na2HPO4·12 H2O 1.84 g,柠檬酸 0.51 g,DDW 100 ml

 

6. 显色液(现配现用):底物 Buffer 10 ml,OPD 2 mg,30% H2O2 2 ml

 

7. 终止液 2 mol/L H2SO4

 

8. 重组人 TFAR19,HRP 标记的羊抗人 IgG9 ELISA 板,Tip,移液器,ELISA Reader(OD 490 nm),洗板机

  

操作步骤

 

1. 用包被 Buffer 稀释的重组人 TFAR19(1 mg/ml)包被 ELISA 板,100 ml/well,37 °C 孵育 2 h 或 4 °C 过夜(一般 24 h 以上)。

 

2. 洗涤 Buffer 洗板三次,加入封闭液,200 ml/well , 37 °C 孵育 2 h 或 4 °C过夜。

 

3. 洗涤 Buffer 洗板三次,加入不同稀释度的病人血清(3 个重复孔)100 ml/well ,37 °C 孵育 1 h。设包被 Buffer、洗涤 Buffer 、封闭液为阴性对照。

 

4. 洗涤 Buffer 洗板三次,加入 1:2 500 稀释的 HRP 标记的抗人 IgG, 100 ml/well,37 °C 孵育 1 h。

 

5. 洗涤 Buffer 洗板三次,加入显色液,100 ml/well,避光反应 10~15 min。

 

6. 加入 H2SO4 终止反应,50 ml/well。

 

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度值,分析和比较病人血清和正常血 清中 TFAR19 自身抗体的表达水平。

 

8. Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的 TFAR 19 蛋白的表达水平。