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细胞组分的分离与纯化原理及过程

研究人员对细胞组分进行分级分离的原因有很多。他们可能希望,当感兴趣的蛋白在某些条件下或某种处理之后转位时,对其进行追踪;或者是获得有活性的亚细胞结构构建无细胞体系,从而在体外对一些复杂的生物学过程进行模拟研究;抑或是分离相当纯度的亚细胞器用于电泳或色谱分析,从而建立相应的亚细胞器蛋白质组数据库。细胞组分的分离与纯化分为传统的离心分离纯化法,以及亲和纯化-免疫磁珠分离纯化法,具体如下。

细胞组分的分离与纯化

 

1、离心分离纯化法

离心方法,包括差速离心法和密度梯度离心法,密度梯度离心法又分为速度-区带密度梯度离心法和等密度梯度离心法。 

在选用合理的方法对细胞或组织进行破碎后,首先要进行差速离心法,即根据不同离心速度所产生的不同离心力将各种细胞组分和颗粒分离开来。各种细胞器和颗粒典型的差速离心顺序见下表。

各种细胞器和颗粒典型的差速离心顺序

经过多次复杂的差速离心也可纯化各种亚细胞器,但常常是事倍功半,很大的离心工作量,却得到不太高的纯度。此时,可以将差速离心得到的沉淀物再进行密度梯度离心进一步纯化。

在速度区带离心中,由于不同组分颗粒在梯度液中沉降速率的差别,而在离心的某一时刻形成了数个含有单一组分颗粒的区带。样品在离心后与梯度液一起收集,用常规技术去除梯度液后就得到了某个较纯的成分。每个单一组分的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。

与速度区带离心法不同,等密度梯度离心是根据细胞组分颗粒的不同密度来进行离心分离的,即根据组分颗粒的浮力。细胞组分沉淀可以铺在梯度液之上,也可置于梯度液之下,甚至和梯度液混在一起。在离心过程中由于组分颗粒各单一成分向各自的等密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。

根据以往文献报道,分离纯化各种细胞组分颗粒推荐使用的密度梯度介质和离心条件如下表。

密度梯度介质和离心条件

综上所述,离心法分离纯化细胞组分可以一次性对大量的细胞或组织粗提液进行分离纯化,并将其富集浓缩成较小的体积以适应后续的分析研究。但也存在一定的局限性,具体表现在:第一,差速离心法贴壁效应严重,常在离心管的一侧出现沉淀,导致颗粒被挤压变形而失活;第二,无法将具有相似密度、大小的不同细胞器分离开来,例如微粒体和过氧化物酶体等;第三,对于异质型细胞器(即具有不同密度、大小的同一类变异细胞器)无法兼顾,只能选择收集某一密度范围的,对于其他密度的只能丢弃;第四,离心所需要的超速离心机及相匹配的转子对于一些小型的实验室来说可能并不容易达到,英泰仪器的生产的离心机中有高速离心机可以达到相关实验的参数。

 

2、亲和-免疫磁珠纯化分离法

免疫磁珠或称免疫磁性微球,具有超顺磁性,可通过抗体与靶细胞器特异性结合并使之具有磁响应性。将免疫磁珠与待分离的混合物共同孵育,免疫磁珠就可通过抗原抗体反应选择性地与靶细胞器物质结合,当此复合物通过一个磁场装置时,与免疫磁珠结合的靶细胞器就会被磁场滞留,从而与其他复杂物质分离开来。

用于细胞组分分离的免疫磁性微球必须具备以下条件:

1)化学性能稳定,不产生凝聚;

2)不与细胞发生非特异性的结合;

3)磁性微球与抗体的结合牢固;

4)磁性微球的大小均匀,磁响应性好,磁性纳米材料的含量均匀一致;

5)磁性微球大小适当,对于较小的细胞器宜选择较大的磁珠,以确保两者之间的相互作用更牢固。

对于免疫分离技术来说,特异性抗体的选择非常关键。抗体必须能够特异性识别并且能够到达位于靶细胞器上的抗原表位。如果抗原表位被包埋在细胞器的内部,则与磁珠相结合的抗体可能就很难达到。据此,免疫分离可以分为直接和间接两种方法。

若抗原表位位于靶细胞器的表面,通常采用直接法,即将特异性抗体直接与磁珠或包被有二抗的磁珠相结合,然后再加入待分离的细胞粗提物进行亲和纯化。直接法的分离速度和效率相对来说较好。但若抗原表位被包埋在内部,则更适合使用间接法。即特意习惯抗体先与待纯化的细胞粗提物混合,然后再加入包被有二抗的磁珠,将抗体-靶细胞器复合物进行免疫分离。当磁珠-靶细胞器复合物形成后,只需要将小管放在磁铁上,在几秒钟内复合物被吸到靠近磁铁的管壁上,然后将上清吸掉即可,而不需要进行离心或过柱,如此轻柔的操作,足以保持亚细胞器的生物学活性。

免疫磁珠分离技术很好的弥补了离心分离法的四点缺陷,但也有其不足之处,即一次分离纯化所得到的样品的体积较小,需要的特异性抗体的量较大。如果特异性抗原表位被包埋在内部,尽管在分离过程中可采用间接法,但最终的分离效率可能会降低。并且那些未与靶细胞器相结合的抗体必须借助密度梯度离心或其他的一些手段去除。

因此,如果将传统的离心法与免疫磁珠法相结合就可以很好的解决各种问题。即对组织或细胞粗提液先进行差速离心,然后将相应的沉淀或上清进行进一步的密度梯度离心。将收集的比较富集的组分合并,用于免疫磁珠的分离。这样就可以获得具有一定数量的相当纯度的细胞器组分颗粒,以便后面的其他分析操作。