中国一流的离心机生产企业
专注生物医疗、实验室离心机

利用96孔板离心机进行Sanger测序步骤及常见异常峰图分析

一、Sanger测序仪简介

双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点,而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此,早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板。然而,对于大量存在着的天然双链DNA分子,因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术,而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。

随着技术的发展,生物素、荧光标记物等化学发光物质代替了对人体有危害的放射性同位素;凝胶电泳也被毛细管电泳法取代。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。

Sanger测序仪可一次接受1个96孔板。包括标记DNA片段的每排8个样品(样品设置)自动变性,接着被毛细管电泳分离。每次分离之后,在8根毛细管中的可替换媒介(分离胶)都被自动替换。分离胶是由一个容易替换的胶管供给的,它能有效的供应1块96孔板。具体如下图。

Sanger-Seq-machine

检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的。四色染料标记终止反应试剂盒用于对样品进行碱基序列分析。染料标记引物则用于对样品产生的片段长度进行分析。分离之后,8根毛细管中的每根产生的原始数据信号都自动处理产生高质量的碱基序列或片段序列。原始数据和分析数据储存在数据库里,都能够以与普通分析应用程序兼容的格式输出。

 

二、Sanger测序操作步骤

1、分离纯化模板DNA

1)应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者PCR产物;

2)将DNA储存在灭菌水里。

注意:不要使用DEPC处理的水,水中不能有EDTA,否则将抑制测序反应。

2、DNA模板定量分析

1)通过紫外分光光度计定量DNA模板,DNA模板的浓度应该>0.1ug/ul;

2)通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。

注意:准确定量DNA模板是测序反应中十分重要的一步。

3、测序反应

1)和普通PCR相比,测序PCR,使用的引物为单向,且对模板的浓度及纯度要求相当高。

2)PCR 产物的测序一般使用PCR的其中一条引物;克隆的测序,引物一般位于多克隆位点两端,不同的载体测序的“通用”引物不同。

Sequencing-step

4、测序反应后纯化

1)乙醇沉淀(利用96孔板离心机)等方法去掉反应产物中的dNTP,ddNTP和盐分;

2)纯化得到DNA测序反应产物。

DNA-sequencing-reaction

5、On-line变性、毛细管电泳和检测

1)荧光标记的DNA链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离;

2)激光诱导的荧光终止剂被检测器识别,直接阅读DNA的核苷酸序列。

DNA-nucleotide-sequence

6、数据分析

1)引物之后的20bp甚至50bp之内的序列是不准确的,这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致,该干扰峰和正常序列峰重叠在一起;另外,测序电泳开始阶段电压有一个稳定期。

2)序列末端容易产生N值,峰图较杂。由于测序反应的信号是逐渐减弱的,所以序列末端的信号会很弱,峰图自然就会杂乱,加上测序胶的分辨率问题,如果碱基分不开,就会产生N值。

3)每个测序反应会提供两个结果,一个是序列,一个是峰图;序列可以用Word,DNAStar、写字板等软件打开,峰图可以用Chromas软件及其他综合性软件打开。

Chromas-peak-figure

 

三、常见异常峰图及其分析

1、PCR产物测序时出现重叠峰

1)可能原因一:模板中有碱基缺失,往往是单一位点或两个位点碱基缺失导致测序结果移码。

reason-a

解决方法:将PCR产物克隆到质粒中挑单克隆测序,或将PCR产物进行PAGE纯化后再进行测序。

2)可能原因二:PCR产物不纯,含部分序列一致的两种以上的片段,长度不一。

reason-b

解决方法:主要原因是PCR产物没有纯化,含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段,将PCR产物进行PAGE纯化后再进行测序。

3)可能原因三:测序引物有碱基缺失,其和模板的碱基缺失有些类似,所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码,而引物碱基缺失的话,则从测序一开始就出现移码,表现在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

reason-c

解决方法:重新合成引物,或将引物进行PAGE纯化。

2、克隆测序时出现峰形重叠

可能原因:所挑选的重组子不是单克隆,所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒;或是送测序的菌液污染。

reason-2a

解决办法:重新挑单克隆的菌落,提质粒或送菌液再次测序。

3、polyA/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减

可能原因:RACE测序时经常遇到这种情形。在PolyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象,而在C/G cluster之后往往导致测序信号的衰减或者直接中断。

polyA-TCG-cluster

 

解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly结构处,即可完成模板全长的拼接。如果是较长的C/Gcluster,可以使用特殊的试剂盒进行测序。

4、基因中含有重复序列

可能原因:样品中含有重复序列导致的测序结果和polyA/T的结果一样,会导致Frame滑动,较短的重复序列会导致测序结果出现移码;而较长的重复序列会使定序信号衰减。

Repetitive-sequence

解决办法:反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域(但不是一定都能够),通过多次的测序结果比对,拼接可以得到全序列结果。