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密度梯度离心法分离脐血干细胞:分离介质的筛选

文章使用 3 种质量浓度的聚蔗糖泛影葡胺分离液分离脐血单个核细胞,用细胞计数法、活细胞染色法及流式细胞计数仪分析单个核细胞的表面标志,以探讨密度梯度离心法分离人脐血干细胞分离介质的最佳浓度,建立临床级干细胞分离应用方案,使用的离心机设备为冷冻低速离心机
结果显示,质量浓度(1.073 0±0.000 1) g/mL 的聚蔗糖泛影葡胺分离液是分离间充质干细胞的最佳介质,质量浓度(1.075 0±0.000 1) g/mL 的聚蔗糖泛影葡胺分离液是分离造血干细胞的最佳介质,两步法是分离脐带血干细胞的最佳流程。
系统研究了聚蔗糖液-泛影葡胺分离介质分离脐带血干细胞最佳应用浓度,建立了密度梯度离心法分离脐带血干细胞最佳分离流程。但密度梯度离心法尚不能分离纯化的干细胞群。(密度梯度离心法原理:http://www.ytyq.com/jishu/813.html
 
脐血由于其来源容易,所含细胞种类和数量比较多,比骨髓和外周血中的细胞更为原始,且其临床应用不涉及社会、伦理、法律方面的限制等优势。应用脐血造血干细胞治疗血液系统疾病,无论技术、方法,还是基础研究均比较成熟。脐血间充质干细胞可以分化为成骨、软骨、脂肪细胞等[3],内皮干/祖细胞治疗缺血性疾病,已经在临床有突出的疗效。国内、外分离脐血干细胞方法常采用磁珠/流式细胞分选法、脐血库仪器/羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同,各类方法有其自身特点。磁珠法或流式细胞分选法应用相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体,但细胞收获率较低,适宜做分析及科研应用。脐血库分离干细胞常用羟乙基淀粉沉淀和仪器离心分离法,分离的细胞量大、成分较多但混有大量红细胞,适合用作大量分离、储存干细胞。密度梯度离心法多采用Percoll、Ficoll分离液分离细胞,得到单个核细胞群,该细胞群成分复杂,纯度不高。但密度梯度离心法分离脐血单个核细胞由于细胞得率高、方法简单等突出优点,有望成为制备临床级干细胞的优选方法,分离介质以聚蔗糖泛影葡胺最为常用。应用脐血分离干细胞的目的是获得以干细胞(间充质干细胞、造血干细胞)为主要群体的单个核细胞群。用聚蔗糖泛影葡胺为分离介质研究何种密度状态下获得的干细胞最多,目前尚未深入研究。文章在前期工作基础上,探索密度梯度离心法用3种不同质量浓度分离液分离脐血单个核细胞,比较分离单个核细胞不同亚群的比例和纯度,试图找出用密度梯度离心法获得干细胞比例和纯度较高的分离介质。
分离液分离脐血单个核细胞表达直方图
3种质量浓度的分离液配制:在室温18-20 ℃下,将9%聚蔗糖液与33.9%泛影葡胺液按比例混合,充分混匀后,用比重计测混合液相对密度,得到(1.077 0±0.000 1),(1.075 0±0.000 1),(1.073 0±0.0001 ) g/mL 3种质量浓度的分离液。过滤除菌,4 ℃避光保存,可保存3个月。
羟乙基淀粉沉淀红细胞:取枸橼酸钠抗凝脐血80-130 mL,无菌操作加入500 mL圆形沉降瓶中,加脐血量2倍体积的PBS,充分混匀。加脐血量2倍体积6%羟乙基淀粉,充分混匀,盖盖(不盖紧),20 ℃,静置60 min。
密度梯度离心法分离单个核细胞:吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液,缓慢加至细胞分离液液面上(上清液∶细胞分离液为1∶1)。置离心机上,4 ℃离心700×g,离心30 min。离心后用移液管伸到单个核细胞(云雾层混浊带)层,轻轻吸出,加入到D-Hank’s液中,洗涤细胞3次。锥虫蓝拒染法检测细胞活性。取2滴细胞悬液加1滴2%锥虫蓝染液,5-10 min后取样作湿片,高倍镜检。死细胞被染成蓝色,活细胞不着色,总共计数200个细胞。