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室温酶解结合差速离心法和OPN/MMP9 在分离培养的子宫腺上皮细胞过程方法和结果

室温酶解结合差速离心法分离培养子宫内膜上皮细胞及评估
目的: 
探索室温酶解消化结合改良式差速离心法在分离培养子宫内膜腺上皮细胞的可行性,为进一步探索子宫内膜药物干预时机的选择提供依据。 
方法:  
1.  收集子宫腺肌症患者的子宫内膜标本, 所得内膜分为两份,一份采用室温酶 解结合改良式差速离心法(改良组)分离,一份采用 37℃水浴消化结合筛网法(对照组)分离,并用光镜、免疫细胞化学图像分析进行细胞鉴定、纯度分析,分别比较两种方法分离培养子宫内膜腺上皮细胞的数目、纯度。 
2.  应用光镜观察细胞形态学变化,应用四甲基偶氮哩法(MTT)测定细胞不同时间点的 OD 值,绘制生长曲线。  
结果: 
1.改良组每 1g 内膜组织可得到(9±1.7)×107/mL 个腺上皮细胞,免疫细胞化学角蛋白表达阳性,纯度达(97.8±0.002%;对照组可得到(3.9±0.78)×107个腺上皮细胞,角蛋白表达阳性,纯度达(88.6±0.006%,改良组分离的腺上皮细胞数量和纯度均明显高于对照组(P<0.05)。培养无一例发生污染。 
2.光镜下观察,  两组 EEC 外观特征相似,细胞形态无差异,两组细胞生长周期有显著性差异,改良组细胞于 15 天开始衰退,而对照组细胞于 8-10 天开始衰退。 
3.MTT 结果显示两组细胞在不同时间点的 OD450值在 3~7d 随时间增加而升高。接种培养的两组细胞均于第 3 天贴壁完全,且两组之间 OD3值差异无显著性;两目的: 探索室温酶解消化结合改良式差速离心法在分离培养子宫内膜腺上皮细胞的可行性,为进一步探索子宫内膜药物干预时机的选择提供依据。 
方法:  
1.  收集子宫腺肌症患者的子宫内膜标本, 所得内膜分为两份,一份采用室温酶解结合改良式差速离心法(改良组)分离,一份采用 37℃水浴消化结合筛网法(对照组)分离,并用光镜、免疫细胞化学图像分析进行细胞鉴定、纯度分析,分别比较两种方法分离培养子宫内膜腺上皮细胞的数目、纯度。 
2.  应用光镜观察细胞形态学变化,应用四甲基偶氮哩法(MTT)测定细胞不同时间点的 OD 值,绘制生长曲线。  
结果: 
1.改良组每 1g 内膜组织可得到(9±1.7)×107/mL 个腺上皮细胞,免疫细胞化学  角蛋白表达阳性,纯度达(97.8±0.002%;对照组可得到(3.9±0.78)×107个腺上皮细胞,角蛋白表达阳性,纯度达(88.6±0.006%,改良组分离的腺上皮细胞数量和纯度均明显高于对照组(P<0.05)。培养无一例发生污染。 
2.光镜下观察,  两组 EEC 外观特征相似,细胞形态无差异,两组细胞生长周期有显著性差异,改良组细胞于 15 天开始衰退,而对照组细胞于 8-10 天开始衰退。 
3.MTT 结果显示两组细胞在不同时间点的 OD450值在 3~7d 随时间增加而升高。接种培养的两组细胞均于第 3 天贴壁完全,且两组之间 OD3值差异无显著性;两组细胞于第 6 天开始,改良组 OD450明显高于对照组 OD450(P<0.01),即改良组分离得到的腺上皮细胞的生长速度及活性明显高于对照组(P<0.01),差异有显著性差异。 
结论: 
1.单酶消化结合改良差速离心法能获得高纯度、数量多的子宫内膜腺上皮细胞。  
2.初步了解了原代培养的 EEC 的最佳生长时间为 6-8 天,为药物干预时间的选择提供了可靠地依据。
 
子宫内膜上皮细胞示意图
子宫内膜上皮细胞示意图
 
OPN/MMP9 在分离培养的子宫腺上皮细胞中的表达及意义
目的: 
检测骨桥蛋白/MMP9 在分离培养的子宫腺上皮细胞中的表达的特点,探讨骨桥蛋白/MMP-9 在子宫内膜腺上皮细胞中的表达意义。 
方法: 
1.选择 10 例子宫腺肌症患者作为实验组,6 例子宫肌瘤患者作为对照组,通过对子宫内膜腺上皮细胞的体外培养,采用实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)分析 OPN/MMP-9mRNA 在实验组、对照组子宫内膜腺上皮细胞的表达。 
2.收集分离培养的不同时间的子宫腺肌症患者内膜上皮细胞,采用实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测 OPN/MMP-9mRNA 的表达。 
结果: 
1.OPNmRNA 在培养的子宫内膜腺上皮细胞的表达:实验组腺上皮细胞 OPNmRNA的表达均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);而同一组中增殖期腺上皮细胞 OPNmRNA 的表达与分泌期相比,与月经周期无关,差异无统计学意义(P>0.05) 
2.  MMP-9mRNA 在培养的子宫内膜腺上皮细胞的表达:实验组腺上皮细胞OPNmRNA 的表达均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);而同一组中增殖期腺上皮细胞 MMP-9mRNA 的表达与分泌期相比,分泌期显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。 
3. OPN/MMP-9mRNA 在分离的子宫腺肌症内膜腺上皮细胞培养的不同时间的表达:
腺上皮细胞在分离培养的第 7、8、9 天,OPN/MMMP-9mRNA 表达无明显差异;腺上皮细胞在分离培养的第 7 天,与分离培养的第 3、12 天相比,第 7 天OPN/MMMP-9mRNA 表达显著升高  (P<0.01)。 
结论: 
1. OPNmRNA 在子宫腺肌病内膜上皮细胞中高表达,但与所分离的内膜不同月 经周期无关,无明显月经周期,MMP-9 在子宫腺肌病在位内膜上皮细胞中分泌期高表达,可能与子宫腺肌病的侵袭过程有关,两者在腺肌病的发生发展中发挥重要作用。 
2. OPN/MMP9 在分离培养的上皮细胞中第 7、8、9 天均高表达,较分离培 养的 3、12 天,更进一步证实是原代培养的上皮细胞最佳活性时间为 7-8 天,为进行药物干预的最佳时机。