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实验室几种常用的转染方法

转染(transfection)专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。从本质上讲,和转化没有根本的区别。无论是转染还是转化,其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞,以提高细胞膜的通透性,从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。今天我们来为大家介绍几种细胞转染的方法,供大家在实验室日常工作中使用。

细胞转染

一、物理-化学方法

 

  1. 脂质体转染法:采用脂质体转染试剂,将遗传物质如质粒, siRNA等转移至细胞内。

 

此种方法易于操作且不需要许多步骤或特殊的专业知识。通常情况下,你只需要一种转染试剂和一种兼容的生长培养基 (通常是低血清且具有良好的缓冲作用,使细胞在转染过程中保持活性)。不同的厂商有自己的配方试剂,有些可以为特定的细胞系设计配方,所以检查你的细胞系是否有最佳脂溶性配方。此外,这种方法可与一系列细胞兼容,如HEK 293.

 

脂质体转染试剂价格昂贵,但转染效率高,从长远来看是值得的。

 

  1. DEAE-葡聚糖法:它是一种阳离子聚合物,可以与带负电荷的DNA和蛋白质结合,进而被细胞吞噬。

 

聚合物浓度、核酸或蛋白质与聚合物的比值,以及转染的持续时间是重要的优化参数,另外,此方法对附着细胞的转染非常有效,也可用于某些悬浮细胞系。

 

缺点是一些细胞类型对葡聚糖特别敏感,可能会发生形态变化或者抑制细胞生长。

 

  1. 磷酸钙共沉淀法:DNA与浓缩的氯化钙溶液混合,然后添加到含有磷酸盐离子的缓冲液中,形成磷酸钙-DNA沉淀物,从而被细胞吸收。

 

这种方法价格便宜且被广泛使用,但这种方法转染效率不稳定,可能会发生DNA

聚集等,影响转染的效率,对试剂浓度、PH值等的要求也比较高。

 

  1. 电穿孔法:将细胞短暂暴露于电场中,短脉冲使细胞膜暂时穿孔,可以吸收外来的遗传物质,此方法也适用于传递蛋白质。

 

目前有许多电穿孔装置,操作不需要专门的专业知识,但在购买之前一定要向供应商索要设备的演示,确保它对你的细胞系有效。最佳的电压、持续时间和脉冲数可以增加外来材料的渗透性,对每个不同的细胞系你需要仔细优化这些参数。但是并不是所有细胞都能忍受电穿孔,有些细胞会死亡,另外,电穿孔仪也是相对昂贵的。

 

二、生物方法

 

腺病毒转导:对于转染困难的细胞,利用病毒载体将遗传物质转移到哺乳动物细胞中

 

此方法存在病毒传播的风险,需要适当的安全预防措施。另外,需要包装细胞系产生能携带目的DNA的病毒颗粒。

 

成功转染的诀窍:

 

哺乳动物细胞系的转染并不简单,使用哪种方法取决于很多因素,例如: 你的实验室的预算、电穿孔设备、你的细胞类型等等,选择最适的转染方法会有较好的转染效率。

 

  1. 抗生素耐药性示例----筛选转染成功的细胞

引入遗传物质(通常是一个质粒)的同时细胞会产生一种耐抗生素的基因。在转染的最初阶段,细胞可能会有点“萎靡”,需要时间来恢复,一两天之后,你就可以把它们暴露在抗生素环境下。没有接受质粒的细胞将无法承受,并且会死亡,你就可以用转染的细胞继续你的实验。

 

2.尽早确定你的转染效率

比较不同转染方法的一个快速而简单的方法是使用一个携带荧光标记蛋白的质粒,这样你就可以在显微镜下观察转染的细胞。你可能需要尝试几种不同浓度的DNA / siRNA来确定你的细胞系的最佳转染效率。

 

3.尝试使用永生细胞系

与原始细胞系相比,永生细胞系无疑更容易工作,但仍然可能会观察到细胞毒性作用,影响整个转染效率。