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DEAE-纤维素纸插片电泳法

    本法足Dretzen1981Cirvitz的方法基础上改进而成。DEAE-纤维素即二乙基氨基乙基(diethvl-aminoethyl)纤维素,在它的纤维骨架链上,连接有许多阳离子交换基团,是一种吸附阴离子基团的阴离子交换纤维素,它能结合带负电荷的DNA分子。DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后,将感兴趣的电泳DNA片段转移至DFAE纤维素纸上,然后再用高离子缓冲液从DEAE滤膜上洗脱

DNA

    本法的优点是操作较简单,可以同时进行多个DNA片段的回收,对于5kb以下的DNA片段回收率好,回收DNA样品的纯度非常高,可用于转基因动物实验,在以后的DNA工具酶操作前,不需进一步DEAE - Sephacel柱纯化。此法的缺点是对于5kb以上的DNA片段的回收率较低,结合在DEAE滤膜上的单链DNA也很难洗脱,不宜用于15kb以上的双链DNA片段及任何大小的单链DNA回收、试剂:

    DEAE纤维素纸(如:SchleicherSchuell NA - 45

    10mmol/L.EDTA (pH8.0)

    0.5mol/LNaOH

 

    低盐漂洗缓冲液:

    50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

    0.15mol/L NaCl

    lOmmol/L EDTA(pH8.0)

 

    高盐洗脱液:

    50mmol/L Tris.CI (pH8.0)

    1mol/L NaCl

    10mmol/L EDTA (pH8.0)

 

    酚/氯仿:

    10mol/L NH Ac

    3mol/L NHAc( pH5 .2)

    TE (pH7.6)

乙醇

 

仪器类:实验中如果需要用到离心机可以联系英泰仪器!

DEAE-纤维素


操作步骤:

    (1)内切酶酶解DNA样品,使感兴趣的DNA片段量在500ng以上,适当浓度的琼脂糖凝胶(含0.5μg/EB)电泳分离DNA片段,用手提式长波紫外线灯观察确定所需DNA片段的带型位置。

    (2)在所需DNA带的前缘,用眼科解剖刀切开凝胶,切口长度略宽于DNA区带的宽度(两侧各长出2mm)

    (3)戴上手套,剪下一长方形小片DEAE纤维素纸,宽度略大于琼脂糖凝胶的厚度,长度与凝胶上的切口相当,将DEAE纤维纸片浸入iOmmol/L EDTA (pH8.0)溶液中5分钟,再浸入0.5mol/L 

NaOH溶液巾5分钟,然后用无菌水漂洗6次。处理好的DEAE纤维素纸若不马上使用,可以在无菌水中4℃保存几周。使用过大的DEAE纤维素纸片,会减低DNA的回收率。

    (4)用扁头镊(鸭嘴镊)轻轻分开凝胶切口,小心插入DEAE纤维素纸片,撤出镊子,小心使切口紧密合拢,不要在DEAE滤膜与凝胶之间留下气泡。

    (5)5Vcm的电雎继续电泳,直到所需的带全部迁移到DEAF纤维素纸片上为止。不时用手提式长波紫外线灯观察电泳进展情况。其间应注意:

        ①电泳缓冲液只需刚好遮盖凝胶表面,过多的缓冲液应用吸管吸去;

        ②当所需DNA带迁移人滤膜上后,不必再延长电泳时间,否则则会带上一点琼脂糖中的杂质;

        ③最好在所需DNA区带的后面插入DEAE纤维素纸片,以防止不需要的DNAr电泳至滤膜上。

    (6)止电泳,用鸭嘴镊取出所需的DEAE纤维素纸片,室温下,浸于5- iOml低盐漂洗缓冲液中,洗去滤膜表面粘附的琼脂糖颗粒。不要让DEAE纤维素纸干燥,否则会导致DNA不可逆地结合在纤维素纸上而洗脱不下来,影响回收率。

    (7)DEAE纤维素纸片转移至Eppendorf管中,加入适量的高盐洗脱液淹没纸片,纸片可轻柔折叠或挤压,但不能过度挤紧,65℃保温30分钟,不时振荡并检查纸片是否完全浸没在液体巾

    (8)吸出洗脱液再加入适当容积的洗脱液,65℃保温15分钟,合并两次洗脱液,用紫外线灯检查纸片上是否还有溴乙锭染色的DNA

    (9)洗脱液用酚,氯仿抽提1次,上清用0.2倍容积的10mol/L醋酸铵和2倍容积的乙醇(4℃预冷)室温沉淀10分钟,12000g,室温离心20分钟,弃上清,DNA沉淀用70%乙醇漂洗数次,1200g,再离心5分钟,去乙醇,真字干燥2分钟,加3~5μl TE (pH7.6)溶解DNA。应注意:

        ①加入10l/g的载体RNA(酵母tRNA)可以增加低浓度DNA的沉淀回收率;

        ②若DNA样品用于小鼠卵细胞的显微注射,步骤(9)中沉淀应悬浮在200μlTE (pH7.6)缓冲液中,再加入25μl 3mol/L醋酸钠(pH5.2)2倍容积乙醇重新沉淀DNA1次,然后加溶于3~5μTEpH7.6)缓冲液中备用。

    (10)50μg左右的DNA进行电泳,检查回收的质量并参照分子量标准的相近区带,估计DNA样品的浓度。操作中应注意:

        ①为了从DEAE纤维素纸片中充分洗脱DNA,可适当增加高盐洗脱液的用量,再用未经水饱和的正丁醇抽提浓缩洗脱液,同时去EB然后用乙醇沉淀DNA

        ②若滤膜面积较大,可采用以下方法洗脱:A.在10.5ml Eppendor管底部穿1个细孔,套在11.5mlEppendorf管中;B.DEAE滤膜放入小Eppendor管中,用防水蜡膜从管外面封住管底细孔,加入高盐洗脱液,将滤膜用玻璃棒搅成碎片,65℃保温30分钟;

        ③将0.5ml Eppendor管底的蜡膜去掉.套上1个去盖的1.5ml Eppendorf管,离心30秒钟,再加高盐洗脱液,离心1次,合并两次洗脱液,以后操作同步骤(9)(10)