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低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法回收DNA片段

    在琼脂糖主链导人羟乙基修饰后,其凝固温度降为30℃,融化温度为65℃,这一融化温度低于绝大多数双链DNA的变性温度。利用这类凝胶纯度高熔点低特点,Wieslrnder等人发展了一项颇为简单的DNA片段回收技术,回收DNA质量对于DNA的连接、探针标记以及内切酶消化等反应完全适合。本方法中分离所使用的离心机欢迎大家选购英泰离心机。

操作步骤:

    (1)先灌制普通凝胶,然后在离加样孔适当距离处切下一定大小的普通凝胶,用相应浓度的低熔点琼脂糖填充,室温中凝固,4℃可加速凝固,凝胶中含0.5ug/ml溴乙锭。

    (2)将待分离的DNA样品上样电泳,当感兴趣的DNA片段迁移至低熔点凝胶内,停止电泳、电泳最好在4℃下进行,以防低熔点凝胶溶化。

    (3)在长波紫外线灯下,切下含所需DNA片段的低熔点凝胶,移入11.5mlEpp endorf管中。

    (4)加入凝胶条5倍容积的20mmol/L TrisCl (pH8.0)1mmo/L EDTA( pH8.0)65℃水浴巾加温5分钟熔化凝胶。

    (5)冷到室温时加入等容积的0.1mol/L TrisClpH8.0)饱和的酚,强烈振荡混匀20秒钟,室温下4000g,离心10分钟,有机相与水相交界面为白色的低熔点琼脂糖粉末。

    (6)用等容积酚,氯仿、氯仿各抽提1次。

    (7)上层水相转移至1个清洁的Eppendorf管中,加入0.2容积的1Omol/L醋酸铵,2倍容积在预冷的无水乙醇,混匀后,室温下放置10分钟。4℃,12 000r/min,离心20分钟,回收沉淀DNA,弃上清。DNA70%乙醇漂洗1次,12 000g.离心5分钟,去乙醇,真空干燥2分钟,加适当容积TE溶解。若必要,可进一步经DEAE - Sephacryl柱层析纯化。

    近年来,此法有些经验和改进值得借鉴。ParkerSuuhl等的经验表明,含DNA的低熔点凝胶条经熔化后,可直接加入酶反应缓冲液中进行DNA连接、探针标记及内切酶消化等反应,大大简化了DFIA回收的操作程序。1989Burmeister等报道另一种从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA片段的方法:

    ①将低熔点凝腔条(含所需DNA片段)移入20倍容积的lOmmol/L TnsCI (pH7.6)5mmol/L EDTA (pH8.0)0.1mol/L NaCl溶液中,室温放置30分钟;

    ②取出凝胶条移人1个清洁的Eppendorf管中,加入1倍容积的l0mmol/L TrisCl(pH7.6)5mmol/L EDTApH8.0),0.1mol/L NaCI溶液;

    ③加入无DNA酵的琼脂糖酶(agarase Cal Biochem公司),l00ml的凝胶用2个单位,37℃消化12 - 61小时,使琼脂糖裂解成单糖。此时可以直接用于连接,补平酶切等反应及转化实验。

    ④若需要,经酚,氯仿、氯仿分别抽提后,上清中加入2倍容积的TE( pH7.6),然后加入0.05容积的5mol/LNaCl2倍容积乙醇混匀,0℃放置15分钟沉淀DNA12 000g4℃离心15分钟。小心吸弃上清,DNA沉淀用70%乙醇漂洗1次。12000g,离心5分钟,弃卜清。室温下蒸发乙醇,DNA溶于适当容积的TE (pH7.6)中。