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通过台式离心机进行肾单层细胞培养

    组织培养就是将组织或细胞从机体取出,用人工方法培养使组织或细脑在体外得以生存、生长和繁殖。组织培养分为器官培养、组织块培养和细胞培养。目前工作中应用较广的是细胞培养。常用于病毒病的诊断和生物药品(疫苗、诊断抗原等)的生产。

 

    组织培养的方法很多,大体分为悬浮培养和固定培养两类。悬浮培养是将切碎的组织块通过离心机进行离心分离,然后将通过台式离心机分离出来的分散的细胞放在适当的培养液中,让其浮游于液体小进行培养,然后接种病毒。

 

    另外还有固定培养法是使组织块通过台式离心机分散的细胞粘附与容器壁上进行培养,待细胞生长良好后接种病毒。病毒在组织培养细胞中繁殖的主要标志是细胞病变(坏死、崩解、脱落等),细胞融合或形成包涵体,对红细胞的吸附作用等。

 

    下面简单介绍通过台式离心机进行“肾单层细胞培养”的一般操作技术。

 

    1.取肾:用无菌操作取出断乳前后幼龄动物的肾脏置灭菌平皿中,剪去留的被膜和脂肪,并纵向切成两半,剪去肾的被膜和脂肪,并纵向切成两半,剪去肾盂及髓质部分,用含双抗(指青、链霉素,下同)的汉克氏液洗净,移置小烧杯中,剪成乳糜状,再用汉克氏液洗2—3次,至液体澄清无血细胞为止。

 

    2.消化;加入10倍的0.125%胰酶液进行消化。有热消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)两种。消化的时间根据不同的组织细胞和所用胰酶的活性而定,直至聚成絮状的肾组织又分散开。取出倾去胰酶,用汉克氏液洗涤数次,然后加入少量乳汉液,用吸管进行吹打(即吸入和吹出)10-20次,使组织分散为细胞。将分散的细胞经2—3层消毒纱布过滤,取滤液置于台式离心机中以1500转/分离心十分钟,弃去上清液,加适昆乳汉液混匀,再次通过台式离心机离心,最后加入乳汉液使细胞悬浮其中,收集于灭菌三角瓶中。

 

    3.细胞计数和分装:取已制好的细胞悬浮液,用计数白细胞的方法计数,根据计数结果,用营养液(pH6.8—7.0)稀释为每毫升含50-60万细胞,分装于小扁瓶中(容量约50毫升的扁瓶加悬液约5毫升),也可分装在链霉素小瓶中。

 

    4.培养:在37℃培养,3—4天即可粘附瓶壁形成单层细胞,以后每过3—4大更换一次维持液。

 

    5.接毒;将病料剪碎,按1:4加含双抗的汉克氏液研磨成乳糜状,经冻融处理使细胞破碎,病毒充分释放,用台式离心机,将转速控制在3000转/分左右离心15分钟,将上清液接种到已生长单层细胞的培养瓶中,在37℃温箱中吸附30-60分钟,然后加入维持液继续培养。

 

    6.收获病毒:每日或隔日用低倍显微镜观察细胞病变情况,当有50-75%细胞出现病变队时可收集培养瓶中液体,从放在冰箱(-20℃)中保存,此即繁殖的病毒液。

 

    7.注意事项:培养皿及其他使用器具的洁净、台式离心机的使用、水的质量、酸碱度、无菌操作等,都是关系到组织培养成败的重要问题,必须严格规定的要求去做,