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实验室样品制备超离心法

    根据需求和应用不同,实验室离心机使用的分离方法不同。作为分离方法,离心技术在生物化学研究中得到广泛应用。实验室离心制备超离心法可用来分离细胞、亚细胞结构或生物高分子。根据分离的原理不同,制备超离心法又可分为差速离心法和密度梯度离心法两类操作方法。

    1.差速离心法

    差速离心法又叫分级分离法。装有不均一粒子的离心管在实验室离心机中高速旋转时,大小、密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管的底部。如果设计一定的转速和离心时间,沉降速率最大的组分将首先沉淀在离心管底部,沉降速率中等及较小的组分继续留在上清液中。将上渭液转移至另一离心管中,提高转速并掌握一定的离心时间,就可以获得沉降速率中等的组分。如此分次操作,就可以在不同转速及时间组合条件下,实现沉降速率不同的各个组分的分离。

   用差速离心法分离到的某一组分,其实并不十分均一,沉淀中往往混有部分沉降速率稍小一些的组分。此时,可在沉淀中添加相同介质令沉淀悬浮,再用较低转速离心.获得较纯的沉淀而洗去大部分杂质。如此反复采用高速、低速离心操作.即可获得较纯的部分。

    差速离心法是基于不同组份沉降速率不同而实现混合物分离的方法,操作比较简单。但差速离心法的效率低、费时间。得到的组分不太均一,悬浮洗涤方法虽然可以提高分离组分的纯度、但会降低其回收收率,当组分差异过小时,多次洗涤、分离也将无济于事。此时,就需要考虑换用分辨率更高的离心方法。

    2.密度梯度离心法

    离心操作如果在一种连续密度梯度介质中进行,这类离心方法就是密度梯度离心。

它比差速离心法复杂,但具有很好的分辨能力。密度梯度离心可以同时使样品中几个或

全部组分分离,这更是差速离心法所不及的。根据操作方法的不同,密度梯度离心法可分

为速率区带离心和等密度梯度离心两种。

    (1)速率区带离心

    首先在离心管中灌装好预制的一种正密度梯度介质液,在其表面小心铺上一层样品溶液(如下图所示)。离心期间,样品中各个组分会按照它们各自的沉降速率沉降,被分离成一系列的样品组分区带,故称速率区带离心。颗粒在水平转头中的速率区带分离

1.装满密度梯度液的离心管    

2.把样品加在梯度液的顶部

3.在离心力的作用下颗粒根据各自的质量按不同的速度移动

    预制密度梯度介质的作用有两个:一是支撑样品.二是防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用。但是样品掖的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度,否则就不能使样品各组分得到有效分离。也正因如此,速率区带离心时间不能过长.必须在沉降速率最大的样品区带沉降到离心管底部之前就停止离心。不然,样品中所有的组分都将共沉下来,不能达到分离的目的。速率区带离心法依据样品中各组分沉降速率的差别而使其互相分离。离心过程中。各组分的移动是相互独立的。因此,S值相差很小的组分也能得到很好的分离,这是差速离心法做不到的。但速率区带离心不适于大量制备实验。

    (2)等密度梯度离心

    如果离心管中介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度,离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带(如下图所示),这种分离方法称为等密度梯度离心。

    等密度梯度离心时颗粒的分离

    1.样品和梯度的均匀混合液

    2.在离心力的作用下梯度重新分配,样品区带呈现在各自的等密度处在等密度梯度离心中,组分的分离完全取决于组分之间的密度差。离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带,也不会发生共沉现象。