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自制快速高效电洗脱法

    上述电洗脱法中,透析袋电泳洗脱法容积较大,挖槽法需不时吸出槽内液体,其它方法皆需购买特殊的回收装置,下面介绍一种自制的简单体系,方便、实用、经济,不受条件限制,回收率高(达80%)、质量好。

操作步骤:

    (1)在长波紫外线灯下确定并切下所需DNA带的凝胶条。

    (2)将凝胶条放人1l.5ml的微量移液枪枪头中,0 6%的琼脂糖(用相应的1×电泳缓冲液配制),化胶后冷却至50℃,加入含凝胶条的l.5ml枪头中,使0.6%琼脂糖液面高出凝胶条l- 2mm,避免产生气泡,室温下使琼脂糖凝固。1.5ml枪头中灌人的琼脂糖量决定于该枪头顶端所需留下多少空间,可根据所需洗脱的DNA量多少而定,一般为300/u左右。

    (3)切除灌好胶的1.5ml枪头尖端(2cm左右),顶端加入l×电泳缓冲液(TBETAE均可)。

    (4)取另11.5ml枪头,切除尖端部分3.2cm左右前端放置1个单层透析膜,插入步骤3准备好的枪头顶端,避免产生气泡,检查是否有液体从透析袋周围析漏。

    (5)将准备好的电洗脱装置,浸于电泳槽的电泳缓冲液液面以下,用胶布固定。

    (6)接通电源,100V150mA电泳15- 20分钟。DNA应全部迁移至凝胶和透析袋之间的溶液中可用长波紫外线灯监测,倒置正、负极电泳30秒。

    (7)停止电泳,取出电洗脱装置,用手纸吸干外面的液体,垂直(凝胶端朝下)小心取出上端1.5ml枪头,去掉透析袋,吸出电洗脱液移人另1个新Eppendorf管中。

    (8)2 5mol/L醋酸铵,2倍容积乙醇沉淀DNADNA溶于TE中备用。

注意事项:

    (1)步骤2操作中,可以先切除1.5ml枪头尖端,然后用胶布封住切口,灌人适量0.6%琼脂糖,使液面高于原凝胶条1 - 2mm,并且留出300 ~ 400ul体积的顶端空隙,凝固后,加入300~400ul 1×TBE,再去掉尖端封口的胶布。

    (2)将自制电洗脱装置在电泳槽中固定,可以切下1长块1.5ml枪头贮存盒中的插板,先用氯仿将插板粘合固定在电泳槽中,然后将自制电洗脱装置插入板中。

    (3)制作如下图

自制快速高效电洗脱法