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“V”字形内槽电洗脱法

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“V”字形内槽电洗脱法

  • 分类:新闻资讯
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2020-09-13
  • 访问量:548

【概要描述】

原理:

    本法使用1个特殊的电洗脱装置(如图),其原理是在V字内槽的底部加人高离子浓度的电泳缓冲液,其上部分及整个电泳外槽中加入低离子浓度电泳液,DNA迁移至高离子浓度溶液部分

时,由于此处电荷多,电阻极小,电压降很小,DNA迁移率急剧下降,在2小时内,DNA几乎不能迁移出该高离子浓度溶液,从而达到回收并浓缩DNA的目的。其优点足:不需透析膜,同时可以回收多个不同的DNA样品,回收率高,也可以用于RNA及蛋白质特定分子的回收,洗脱体积小(50ul),具有浓缩功能,洗脱时间短(30分钟),操作简单安全。回收的DNA的纯度适用于分子生物学中大多数工具酶反应。

试剂:

    高盐电洗脱缓冲液:

    7.5mol/L醋酸铵

    1%甘油

    10mmol/L Tris-CI (pH7.8)

    0.05%溴酚蓝

    0.1或0 5×TBE电泳缓冲液

    酚、氯仿、乙醇

操作步骤:

    (1)在长波紫外线灯下,切割下含所需DNA带的凝胶条,将凝胶条置于“V”字内槽负极端贮胶室

中。

    (2)用带长针头的注射器或枪头上套细长硅胶管的微量移液枪,向“V”字内槽管底加入50 ~ 100ul高盐电洗脱液,然后用0.1或0.5×TBE充满“V”字内槽,最后在电泳装置中灌入0.1或

0.5×TBE至恰好与置胶室巾凝胶表面相平,注意不要使TBE溢过中央隔板。

    (3)接通电源,100V电源洗脱20~40分钟,用手提式长波紫外线灯检查凝胶条中DNA带是否完全洗脱。若需长时间电洗脱,“V”字内槽底部的高盐洗脱液中溴酚蓝,在2小时内也不会迁移或

扩散至TBE中。

    (4)放出电泳装置中的TBE,用微量加样器吸出“V”字内槽中的上层TBE,然后吸出下层含溴酚蓝的高盐洗脱液移至1个清洁的Eppendorf管巾,加入l倍容积TE冲洗“V”字槽,合并两部分

液体。

    (5)用酚、酚f氯仿、氯仿分别抽提DNA电洗脱液各1次。

    (6)上清加2倍容积的无水乙醇,- 20℃放置30分钟,12000g,室温下使用离心机离心10分钟。70%乙醇漂洗DNA沉淀1次,1200g,室温离心5分钟,弃上清,真空干燥乙醇2分钟,加入适当

容积的TE(pH 7.6)溶解DNA。

注意事项:

    (1)在v字内槽中加入上层0.1×TBE时,应小心勿搅动下层的高盐电洗脱液,最好是v字槽两侧同时加入,也可以先在“v”字内槽中充满O.l×TBE,然后用针头插入“V”字内槽底部缓慢加人高盐电洗脱液,在“V”字内槽中不应有气泡存在。

(2)溴酚监足指示剂,若下层高盐电洗脱盐中溴酚蓝没有迁移至TBE中,标志着废溶液巾离子浓度未扩散稀释,DNA分子不会迁移出去。

“V”字形内槽电洗脱法

【概要描述】

原理:

    本法使用1个特殊的电洗脱装置(如图),其原理是在V字内槽的底部加人高离子浓度的电泳缓冲液,其上部分及整个电泳外槽中加入低离子浓度电泳液,DNA迁移至高离子浓度溶液部分

时,由于此处电荷多,电阻极小,电压降很小,DNA迁移率急剧下降,在2小时内,DNA几乎不能迁移出该高离子浓度溶液,从而达到回收并浓缩DNA的目的。其优点足:不需透析膜,同时可以回收多个不同的DNA样品,回收率高,也可以用于RNA及蛋白质特定分子的回收,洗脱体积小(50ul),具有浓缩功能,洗脱时间短(30分钟),操作简单安全。回收的DNA的纯度适用于分子生物学中大多数工具酶反应。

试剂:

    高盐电洗脱缓冲液:

    7.5mol/L醋酸铵

    1%甘油

    10mmol/L Tris-CI (pH7.8)

    0.05%溴酚蓝

    0.1或0 5×TBE电泳缓冲液

    酚、氯仿、乙醇

操作步骤:

    (1)在长波紫外线灯下,切割下含所需DNA带的凝胶条,将凝胶条置于“V”字内槽负极端贮胶室

中。

    (2)用带长针头的注射器或枪头上套细长硅胶管的微量移液枪,向“V”字内槽管底加入50 ~ 100ul高盐电洗脱液,然后用0.1或0.5×TBE充满“V”字内槽,最后在电泳装置中灌入0.1或

0.5×TBE至恰好与置胶室巾凝胶表面相平,注意不要使TBE溢过中央隔板。

    (3)接通电源,100V电源洗脱20~40分钟,用手提式长波紫外线灯检查凝胶条中DNA带是否完全洗脱。若需长时间电洗脱,“V”字内槽底部的高盐洗脱液中溴酚蓝,在2小时内也不会迁移或

扩散至TBE中。

    (4)放出电泳装置中的TBE,用微量加样器吸出“V”字内槽中的上层TBE,然后吸出下层含溴酚蓝的高盐洗脱液移至1个清洁的Eppendorf管巾,加入l倍容积TE冲洗“V”字槽,合并两部分

液体。

    (5)用酚、酚f氯仿、氯仿分别抽提DNA电洗脱液各1次。

    (6)上清加2倍容积的无水乙醇,- 20℃放置30分钟,12000g,室温下使用离心机离心10分钟。70%乙醇漂洗DNA沉淀1次,1200g,室温离心5分钟,弃上清,真空干燥乙醇2分钟,加入适当

容积的TE(pH 7.6)溶解DNA。

注意事项:

    (1)在v字内槽中加入上层0.1×TBE时,应小心勿搅动下层的高盐电洗脱液,最好是v字槽两侧同时加入,也可以先在“v”字内槽中充满O.l×TBE,然后用针头插入“V”字内槽底部缓慢加人高盐电洗脱液,在“V”字内槽中不应有气泡存在。

(2)溴酚监足指示剂,若下层高盐电洗脱盐中溴酚蓝没有迁移至TBE中,标志着废溶液巾离子浓度未扩散稀释,DNA分子不会迁移出去。

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“V”字形内槽电洗脱法

原理:

    本法使用1个特殊的电洗脱装置(如图),其原理是在V字内槽的底部加人高离子浓度的电泳缓冲液,其上部分及整个电泳外槽中加入低离子浓度电泳液,DNA迁移至高离子浓度溶液部分

时,由于此处电荷多,电阻极小,电压降很小,DNA迁移率急剧下降,在2小时内,DNA几乎不能迁移出该高离子浓度溶液,从而达到回收并浓缩DNA的目的。其优点足:不需透析膜,同时可以回收多个不同的DNA样品,回收率高,也可以用于RNA及蛋白质特定分子的回收,洗脱体积小(50ul),具有浓缩功能,洗脱时间短(30分钟),操作简单安全。回收的DNA的纯度适用于分子生物学中大多数工具酶反应。

试剂:

    高盐电洗脱缓冲液:

    7.5mol/L醋酸铵

    1%甘油

    10mmol/L Tris-CI (pH7.8)

    0.05%溴酚蓝

    0.1或0 5×TBE电泳缓冲液

    酚、氯仿、乙醇

操作步骤:

    (1)在长波紫外线灯下,切割下含所需DNA带的凝胶条,将凝胶条置于“V”字内槽负极端贮胶室

中。

    (2)用带长针头的注射器或枪头上套细长硅胶管的微量移液枪,向“V”字内槽管底加入50 ~ 100ul高盐电洗脱液,然后用0.1或0.5×TBE充满“V”字内槽,最后在电泳装置中灌入0.1或

0.5×TBE至恰好与置胶室巾凝胶表面相平,注意不要使TBE溢过中央隔板。

    (3)接通电源,100V电源洗脱20~40分钟,用手提式长波紫外线灯检查凝胶条中DNA带是否完全洗脱。若需长时间电洗脱,“V”字内槽底部的高盐洗脱液中溴酚蓝,在2小时内也不会迁移或

扩散至TBE中。

    (4)放出电泳装置中的TBE,用微量加样器吸出“V”字内槽中的上层TBE,然后吸出下层含溴酚蓝的高盐洗脱液移至1个清洁的Eppendorf管巾,加入l倍容积TE冲洗“V”字槽,合并两部分

液体。

    (5)用酚、酚f氯仿、氯仿分别抽提DNA电洗脱液各1次。

    (6)上清加2倍容积的无水乙醇,- 20℃放置30分钟,12000g,室温下使用离心机离心10分钟。70%乙醇漂洗DNA沉淀1次,1200g,室温离心5分钟,弃上清,真空干燥乙醇2分钟,加入适当

容积的TE(pH 7.6)溶解DNA。

注意事项:

    (1)在v字内槽中加入上层0.1×TBE时,应小心勿搅动下层的高盐电洗脱液,最好是v字槽两侧同时加入,也可以先在“v”字内槽中充满O.l×TBE,然后用针头插入“V”字内槽底部缓慢加人高盐电洗脱液,在“V”字内槽中不应有气泡存在。

(2)溴酚监足指示剂,若下层高盐电洗脱盐中溴酚蓝没有迁移至TBE中,标志着废溶液巾离子浓度未扩散稀释,DNA分子不会迁移出去。

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