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• 作者：微凉
• 来源：英泰运营部
• 发布时间：2020-09-13
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【概要描述】 抗体采集、测定及研究实验是生物学研究领域的一大课题之一。在前面的技术文章中我们有提到通过离心机分离淋巴细胞制作抗体，今天我们来探讨一下抗体效价测定的方法。

 

一、装置、器具

 

需要用到的装置有倒置相差显微镜和低速离心机

 

器械、器材

(1)显微试验板；

(2)微量注射器(50μl、l00μl、250μl)；

(3)循环式分配器(汉密尔顿PB6001)

(4)尼龙羊毛袋(KK总研)；

(5)结核菌素注射器。

 

二、试剂

 

(一)试剂种类

    (1)培养基；

    (2)白细胞分离液；

    (3)5％曙红丫水溶液(和光纯药制)；

    (4)10％中性福尔马林，

    (5)石蜡油(一级)；

    (6)家兔补体(正常家兔血清)。

 

(二)试剂配制

    10％中性福尔马林，用重碳酸盐中和pH调节为7.2—7.4。

 

三、操作方法

(一)巴细胞的配制

    (1)淋巴细胞的采集、分离、配制按前述进行。

 

    (2)将淋巴细胞在培养基中悬浮。

 

    (3)取2m1分离液置于10-15ml离心机的离心管中，使淋巴细胞悬浮液重层。这时，须从离

心管的壁面缓缓重层。

 

    (4)离心分离(将离心机转速控制在1600-2000rpm，20分钟)  这个操作使淋巴细胞在分离液和培养基中间形成白色的带状层。

 

    (5)洗涤  吸淋巴细胞层、移至离心管，加培养基进行洗涤，洗涤三次。

 

    (6)判断淋巴细胞的生存  用生存率80％以上的，如前所述的方法进行，80％以下

的，应重新配制淋巴细胞。

 

    (二)T细胞和B细胞的分离

    (1)将淋巴细胞恳伊液加入尼龙羊毛袋(1.0×15cm，成品)中，37℃培养10—30分钟。

 

    (2)析出 剪掉尼龙羊毛袋底，把液体放到离心管中，仅使B细胞流出。

 

    (3)采集T细胞  析出结束后，将尼龙羊毛袋在加有培养基的烧杯上用手轻轻地揉擦，T细胞掉落，经离心采集。

 

    (三)效价测定法

    (1)准备反应系列  在显微试验板的各孔内滴一滴石蜡油。

 

    (2)添加抗血清  每个孔中加入从10倍依次稀释至约400倍的抗血清lμl：每4孔制成一个稀释倍率。

 

    (3)添加淋巴细胞  在抗体各稀释系列的不同的孔中，各加lμl B细胞、T细胞溶

液，室温下反应30分钟。

 

    (4)添加家兔补体   反应后，各孔中加5μl补体，反应60分钟。

 

    (5)各孔中加2μl 5％曙红部丫水溶液，反应5分钟。

 

    (6)加10％中性福尔马林用结核菌素注射器每孔各加l滴。

 

    (四)判定方法

    (1)淋巴细胞中没有抗体加入时不被曙红染色，有光泽。

 

    (2)和抗体一起的淋巴细胞经曙红染色，没有光泽。

 

    (3)检查各稀释倍率的抗体系列的细胞死亡率。

 

    (4)判断  把50％的抗体稀释倍率作为其抗体效价来表示淋巴细胞死亡率，通常为

×100-1000。