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09-12

热烈祝贺长沙英泰仪器有限公司官网正式上线!

长沙英泰仪器有限公司是行业内的专业离心机生产制造商。主要生产医用离心机,实验室离心机,科研离心机,美容离心机。涉及众多品类,高速离心机、低速离心机、冷冻离心机、高速冷冻离心机、低速冷冻离心机、超大容量冷冻离心机、细胞涂片离心机、血型卡专用离心机、玻片甩干离心机、生物制药专用连续分离离心机等各种类型的离心机,并可根据客户的要求定制各类专用离心机产品。 创业多年来,英泰工程师刻苦技研产品,并积极学习国内外先进的离心机生产技术及设计理念。公司生产技术在国内处于行业前列,已取得离心机机械设计,电气控制,软件创新多项专利技术。公司为实验室仪器标准委员会委员。为国内外众多医疗检验,教学科研,医药研究、生物制品、化工、制药、石油工业、食品研究、农业研究、军事国防、大专院校等提供各种离心机及相关服务,实时关注客户应用需求的创新解决方案,使离心机的操作变得更为简单。帮助客户获得至高的工作效率和更为可靠的安全性。 我们公司较早拥有进出口权,积极拓展外贸业务,主要面向欧洲,美洲,东南亚,中东等国际市场,产品已出口到巴西、印度、美国、德国、日本、俄罗斯、 土耳其、墨西哥、越南、泰国、菲律宾等众多国家。
11-26

高速离心机有哪些维护技术?

高速离心机是一种小型管状离心机,可用于学校,实验室,科学研究所和其他行业。
09-22

实验利器之提取&纯化磁性微球简介

所谓的生物磁珠就是指具有细小粒径的超顺磁微球。   磁珠一般具有超强的顺磁性,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。其次,具有合适的且差别较小的粒径,保证了足够强的磁响应性又不会沉降。再次,具有丰富的表面活性基团,以便可以和生化物质偶联,并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比,把磁珠用于生化样品复杂组分的的分离,能够实现分离和富集的同时进行,有效地提高了分离速度和富集效率,同时也使分析检测的灵敏度大大提升。   通过在磁珠表面包被上特异性抗体、受体等,用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。   磁性微球是近年发展起来的一种新型磁性材料,是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性,所以不仅能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基团(如-OH、-COOH、-CHO、-NH2,等),还能在外加磁场作用下具有导向功能。目前,磁性复合微球已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等诸多领域。   磁性微球主要有两种类型:琼脂糖基质磁性微球和硅胶基质磁性微球。前者主要用于蛋白、抗体的亲和纯化,或者免疫沉淀检测(Immunoprecipitation,IP),后者主要用于核酸纯化。   琼脂糖基质磁性微球   琼脂糖基质磁性微球产品是系列磁珠具有超顺磁性、快速磁响应性、丰富羟基官能团和相对集中的粒径等特点,能够在特殊化学试剂(如 EDC)的作用下将多肽、蛋白、抗体、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面,是医学不分子生物学研究中重要的载体工具。其中粒径分布在 20um 左右的磁性琼脂糖微球,更适合生物检查和纯化实验的需求,粒径适中。   图片来源于antibody-online 硅胶基质磁性微球        硅胶基质系列磁性微球为核酸提取和纯化设计,表面修饰大量硅羟基,能在高盐、低 pH 条件下不溶液中的核酸通过氢键作用和静电作用等发生特异性结合,并与其他杂质(如蛋白)分离,从而达到迅速从生物样品中分离核酸的目的。该方法操作安全简单,并且更便于自动化操作和高通量提取。   主要应用方向:质粒提取,PCR 产物纯化,胶回收, 血液、组织、植物和微生物等样本中基因组 DNA 提取,病毒核酸提取。
09-22

细胞培养实验室离心机等常用的设备

  组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外,尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类:第一类为常用的基本设备;第二类为较高级的特殊设备。   1. 常用的基本设备 (1) 仪器 a)显微镜:倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一,便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。 b) 培养箱:体外培养的细胞和体内细胞一样,需要在恒定的温度下生存,大多数情况下,最适温度是37℃,温差变化一般不应超过±0.5℃,细胞在温度升高2℃ 时,持续数小时即不能耐受,40℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱,如具有较高灵敏度的恒温培养箱及CO2培养箱。 c)干燥箱:用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用,玻璃器皿等须干热消毒。 d)水纯化装置:细胞培养对水的质量要求较高,细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水:即使是用于玻璃器皿的冲洗,也应使用二次以上蒸馏水。 e)冰箱:细胞培养室必须配备。a、普通冰箱或冷藏柜——储存培养液、生理盐水、Hank’s液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。b、低温冰箱(-20℃)——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂,如酶、血清等。 f)细胞冷冻储存器:储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小,取放使用方便及液氮挥发量(经济)三种因素。 g)离心机:进行细胞培养时,常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作,通常需要使用离心机。一般可常规配置4000rpm的国产台式离心机,例如细胞沉降,使用80~100g的离心机即可,离心力过大有时可能引起细胞的损伤。 h)天平:常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。 i)消毒器:一般为高压蒸汽灭菌锅,直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。 j)滤器:目前细胞培养工作中采用的培养用液,包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质,这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能,因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常使用的滤器有Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤器,各种滤器有其使用原理和特点。     (2)培养用器皿 a)培养器皿:供细胞接种、生长等用的器皿,可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。 常用的培养器皿: 培养瓶:由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞,胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量(ml)表示,如250ml、100ml、25ml等;进口培养瓶则多以底面积(cm2)表示。 培养皿:由玻璃或塑料制成,供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有 10cm、9cm、6cm、3.5cm等。 多孔培养板:为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂,可同时测试大量样本,易于进行无菌操作。培养板分为各种规格,常用的规格有:96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。 b)培养操作有关的器皿 贮液瓶:常见的为蓝盖瓶,主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格,如1000ml、500ml、250ml、 100ml、50ml、5ml等。 吸管:主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体,常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管,除可以作吸取、转移液体外,弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。 加样器(移液器):分为微量移液器和电动移液器。用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小,吸量准确、方便。可保证实验样品(或试剂)含量精确,重复性良好。 其他用品:尚有收集细胞用的离心管,放置试剂或临时插置吸管用的试管,装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器,用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽,套于吸管顶部的橡胶吸头,封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗,超净工作台使用的酒精灯,供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。 (3)器械 主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有:手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪(弯剪及直剪),用于解剖动物、分离及切剪组织,制备原代培养的材料;眼科虹膜小剪(弯剪或直剪),用于将组织材料剪成小块;血管钳及组织镊、眼科镊(弯、直),用于持取无菌物品(如小盖玻片)夹持组织等;口腔科探针或代用品,用以放置原代培养之组织小块。   2、特殊设备 细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外,如有条件,可添置一些特殊或先进的设备仪器,以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。例如: (1)酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。 (2) 超低温冰箱(-80℃)——便于储存某些试剂及标本。 (3)旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。 (4) 荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。 (5) 流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。 (6)用于检测细胞培养条件的各种仪器,例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式CO2浓度测定仪等。
09-22

三相卧螺离心机工作原理图解、优点及操作注意事项

卧螺离心机是一种卧式螺旋卸料、连续操作的沉降设备。 卧螺离心机工作原理为:转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转,物料由进料 管连续引入输料螺旋内筒,加速后进入转鼓,在离心力场作用下,较重 的固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。 输料螺旋将沉积的固相物连续 不断地推至转鼓锥端,经排渣口排出机外。 较轻的液相物则形成内层 液环,由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓,经排液口排出机外。 三相卧螺离心机的原理是固液液三相分离, 通常我们所说的油水渣三相分离, 这样一台三相卧螺离心机即可一次性解决三种物料的分离。 以往需要 两台二相卧螺离心机,一台固液分离,先除渣,另一台液液分离,再脱 水,这样生产模式繁琐,后来逐步采用三相卧螺离心机进行油水渣三 相分离,当要分离的悬浮液经进料管进入转鼓后,高速旋转的转鼓产 生强大的离心力把比液相密度大的固相颗粒沉降到转鼓内壁,由于螺 旋和转鼓的转速不同,二者存在有相对运动(即转速差),密度大的固 体(焦油渣)沉降到转鼓壁上。 两相密度不同的清液形成同心圆柱,较 轻的液相(油)处于内层,较重的液相(水)处于外层。 不同液体环的厚度 可通过调液板调节,沉积在转筒壁上的渣由螺旋输送器传送到转筒体 的锥体端,从排料口排入固体积料箱,水和油分别从各自出口排出,整 个处理过程均是自动进料、自动卸料、全封闭、连续式分离、脱水、脱渣。 卧螺离心机的优点 对物料的适应性较大, 能分离的固相粒度范围广 0.005-2mm,在固相粒度大小不均时也能照常分离;能自动、连续、长期运转,维修方 便,能够进行封闭操作;单机生产能力大,结构紧凑,占地小;可以实现 DCS 控制;耐磨性好:螺旋叶片采用堆焊碳化钨硬质合金、喷焊碳化钨 硬质合金、粘结陶瓷片等,出料口采用了陶瓷或硬质合金嵌套。 操作应该注意事项 作为高速转动的离心机, 绝大部分的机械故障以机器振动的方式。 所以作为操作人员对机器的振动和动平衡的常识要有基本了解。 离心机的转鼓和螺旋必须用动平衡的方法来平衡。 有些动平衡由于没 有平衡矫正机,自己解决不了,比如转鼓和螺旋的变形,但在使用过程 中,有些是可以预防的: ① 离心机由于结构的局限性,转筒长度 1680mm,其转鼓和螺旋的 刚度不大,长期处在不变的位置,因自重而弯曲变形,使振动加激。 对于长期不用的机器要半个月盘车一次。 ② 开机要缓慢,防止受热不匀。 ③ 一定按规定的开机和停机清洗程序操作。 ④ 随时注意机器的振动和噪音,及时排除,不能带病工作。
09-22

图解单个肿瘤干细胞分离及其培养实验的方法和步骤结果

当前单细胞水平的研究越来越受到重视,已广泛 应用于单细胞的 PCR 扩增、基因组测序和组织工程研 究等领域。随着肿瘤干细胞研究的不断深入,单个肿瘤 干细胞的有效分离和培养成为肿瘤干细胞发生的分子机制、侵袭和转移、肿瘤干细胞的靶向治疗以及与微环 境的相互作用等研究中需要迫切解决的难题之一。 因此,我们拟建立一套简捷高效的肿瘤干细胞的单细胞 分离技术和培养技术,为相关研究提供技术支持。   目前,单细胞分离方法有4种: (1)手工机械分离 法:在倒置显微镜下直接分离细胞,但易损伤细胞; (2) 荧光流式细胞技术分离法:荧光激活流式细胞分离技术 能够有效获得单个细胞,但是对流式细胞仪的性能要 求较高,仪器价格高昂; (3)激光显微切割技术:能够从 组织中分离单个细胞,但不适用于细胞培养与扩增,且 需要操作者极其熟练地掌握切割技术; (4)显微操控仪: 采用显微操控技术从单细胞悬液中吸取单个细胞,但精细的操作以及贵重的仪器使研究者望而却步。以上技 术的缺陷使之无法得到推广应用,于是有研究人员自行 改良了操作方法,如使用小号静脉注射针及微量移液器 组合进行单细胞分离[11],但是由于肿瘤干细胞粘附性 强,分离时易损伤,效果依然欠佳。因此,我们通过实验 摸索和总结,建立了一套有效防止肿瘤干细胞损伤的简 易单细胞分离技术,并可高效扩增单个肿瘤干细胞。   单个肿瘤干细胞分离及其培养材料 DMEM/F12培养基(Gibco)、Accutase 酶(eBioscience);B27 添加剂,重组人表皮生长因子 (EGF)、重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)均购自Invitrogen;白血病抑制因子(LIF)(Millpore);BJ-40 毛 细玻璃管(北京正天易公司);人结肠癌 SW480 细胞系 来自 ATCC(美国组织培养保藏中心),由上海生物细胞 所提供。人结直肠癌干细胞 SW480-17 细胞由本课题 组自行筛选冻存。   单个肿瘤干细胞分离及其培养实验方法 ①配制培养基 无血清培养基由DMEM/F12、B27、 EGF(20 ng/ml)、bFGF(10 ng/ml)、LIF(10 ng/ml)组成。 1.2.2 制备单细胞分离装置 BJ-40 毛细玻璃管(外径 1.0 mm,内径 0.8 mm)置于 1 mol/L 盐酸中浸泡 24 h,然 后用超纯水连续冲洗,65 °C烘干,高压灭菌备用。取出 细玻璃管在酒精灯外焰烧烤数秒,迅速拉成细丝状制成 口吸管。取无菌塑料管 1 段(30~40 cm),两端分别连接 灭菌的 10 μl 和 100 μl 吸头,10 μl 吸头连接口吸管,建立 口控毛细管单细胞分离装置。 种植单细胞 SW480 用胰酶消化后制成单细胞悬 液备用。应用自制的口控毛细管单细胞分离装置于显 微镜下吸取单细胞悬液然后种植于 96 孔板中,每孔中 加入 1 个细胞。   ②免疫荧光检测 取单个 SW480 细胞无血清培养 30 d 后的克隆球,4%多聚甲醛固定 20~30 min,PBS 洗 涤,0.2% Triton X-100,室温孵育 10 min,PBS 洗涤, 10%正常羊血清,封闭 30 min,吸取羊血清,CD133、 CK7 抗体标记过夜,PBS 洗涤,荧光标记二抗(FITC、 TRITC),室温闭光孵育 1 h,PBS 洗涤,再在每皿内加 5 μg/ml DAPI 染液核衬染 5 min,PBS 洗涤后荧光显微 镜下观察。   ③两种结直肠癌干细胞培养方式比较 挑选单个肿瘤干细胞克隆球消化后制成单细胞悬液备用。取 Corning 35 mm × 10 mm 的皿,加入 10 滴培养基,每滴 20 μl,再加入 2 ml 石蜡油,建立微滴培养池。应用自制 的口控毛细管单细胞分离装置于显微镜下吸取单细胞悬液然后在每个液滴用口吹出一个细胞,种植于石蜡油封闭的微滴培养基中。同样方式吸出细胞分别种植于 96 孔板中,每孔中加入 1 个细胞。倒置显微镜下观察细 胞生长30d。   ④统计学方法 采用 SPSS13.0 软件处理,计数资料 采用χ2检验,P<0.05 表示差异具有统计学意义。   单个肿瘤干细胞分离及其培养实验结果 无血清培养环境下单个 SW480 细胞在 96 孔板中的克隆形成率为 1.04%(2/192)免疫荧光显示克隆球中 CD133 高表达,CK7 几乎不表达而在血清培养环境下 则 相 反( 图 1 )。 采用口控毛细管单细胞分离装置(图 2)共种植了 199 个微滴,微滴中单细胞的数量为 197 个,单细胞分 离的有效率为 98.99%(197/199),未成功的两个微滴 均为 2 个细胞;另种植了 2 块 96 孔板共 192 个孔,其中 单细胞的数量为 184,单细胞分离的有效率为 95.8%(184/192)。 两种培养方式观察比较(图 3、4),第 1 次分裂发生的时间都集中在第 3 天,分裂的概率分别为:微滴培养 24.9%(49/197),96 孔板培养 20.1%(37/184),两者无明 显差别(P>0.05)。微滴培养第 2 次分裂的时间集中在 第 6 天,分裂概率为 20.3%(40/197),而在 96 孔板培养第 2 次分裂集中在第 5 天,分裂概率为 16.8%(31/184),两 者同样无明显差异(P>0.05)。此后微滴中细胞分裂的 时间长于 96 孔板内培养的细胞。11.5%(22/197)的单 细胞在微滴中能够持续扩增 30 d;9.2%(17/184)的单细 胞能够在 96 孔板中能够持续扩增 30 d,两种培养方式 在维持单细胞持续扩增上无明显差别(P>0.05,图 5)。 口控毛细管的单细胞分离装置最初用于卵细胞移植,我们在此基础上简化改造,建立口控毛细管肿瘤 干细胞单细胞分离装置。该装置材料容易获得,不需要 专用设备。毛细玻管在轻烤后管口变得圆滑,口吸操作 力度轻柔可控,能够有效降低分离吸取单细胞时所造成 的机械损伤。采用口控毛细管单细胞分裂装置分离出 来的单个 SW480 细胞能在无血清的培养环境中形成克 隆球,克隆形成率约为 1.04%,并且克隆球中 CD133 的 表达高而 CK7 的表达低,进一步验证为结直肠癌干细 胞。此种方法分离单个肿瘤干细胞以口控毛细管单细 胞分离装置为依托,以无血清培养方式筛选肿瘤干细 胞,操作灵活、简单快捷、便于推广,不仅可以分离肿瘤 干细胞,而且可用于从混合类型的细胞中挑取单一类型 细胞,具有很好的实用价值。 在单细胞培养技术中,我们选用了微滴培养法。微滴培养法最先由 Brinster 建立,应用于卵细胞培养和胚胎发育研究。2010 年 Araki 等观察研究了小鼠精 原干细胞在微滴中的培养,发现小鼠的精原干细胞同样 可以在微滴中发生扩增,而且此方法也可以用来培养其 他干细胞。 图3 动态观察微滴中培养的单个肿瘤干细胞 图4 动态观察96孔板培养的单个肿瘤干细胞 我们将结直肠癌干细胞作为研究对象,分别接种于 微滴和 96 孔板。与传统的 96 孔板培养相比,结直肠癌 干细胞在微滴及 96 孔板中均可获得分裂增生,两者在 分裂时间以及可持续分裂的细胞数量上无显著差异。 但是微滴培养法在操作灵活性及观察便捷性方面具有 明显优势: (1)微滴培养技术可以全方位立体动态观察 目的细胞整个培养过程,并能在分裂的早期阶段再次分 离单个细胞,操作简便快捷,为肿瘤干细胞、肿瘤祖细 胞、移行扩增细胞和成熟肿瘤细胞生物学的动态演变规 律和分子机制研究提供了实验技术基础; (2)石蜡油液 封的培养微滴可以减少培养基的流失,保持微滴中的 温度、pH 值的稳定,特别是某些珍贵而稀少的培养基,能够充分显现微滴培养的优势,而 96 孔板长时间培养时,培养液易蒸发而改变培养基内环境,影响细胞生长;  (3)因微滴置于培养皿中,能多角度灵活操作,而传统的 96 孔板孔径比较狭长,种植细胞时候有一定的难度和局 限。综上所述,石蜡油封闭微滴培养法培养单个肿瘤干 细胞有其独特的优势,可以做为培养单个肿瘤干细胞的首选。 图5 两种培养方式比较 因此,我们根据肿瘤干细胞的特性,建立了一套高效可靠的单个肿瘤干细胞的分离和培养方法,该方法操作简单、成功率高,便于推广,可用于肿瘤干细胞的单细 胞研究。石蜡油封闭微滴培养法培养单个肿瘤干细胞有 其独特的优势,可以作为培养单个肿瘤干细胞的首选。
09-22

通过离心机进行红细胞稀有血型筛选、建库与应用

输血时如血型不合会造成患者出现输血的不良反应,因此使用相符的血型是输血安全的前提保证。而作为人类的重要遗传标志-血型,在近年科学的发展下,人们逐步探索分析,已发现300余种现人类红细胞血型抗原。当今,世界多国正努力建立稀有血型细胞血库,当中对所发现的稀有血型,如Rh、MNSs、P、Kell、Kidd、Lutheran等,建立起稀有血型系统,以保证为稀有血型的患者更加快速及时地提供合适红细胞。   中国稀有血型筛选与建库 在我们的临床研究中,对于稀有血型的筛选工作和具体项目中,对于引发临床不良输血反应的稀有血型抗原或是表型组合是最值得关注的,而事实证明这些稀有抗原或是表型组合往往存在于如Vel、Lan、Jk(a-b-)、Lu(a-b-)、Rhnull、OH等这些高频率血型抗原组以及多个血型系统中,与此同时我们也对如Fy(a-b+)、Di(a+b-)等能引起输血反应和新生儿溶血病的血型抗原的中国人特有的免疫反应而进行的筛选,并希望建立起符合我国国情的稀有血型库。以此来解决我国临床上的稀有血型不足、不良输血反应的发生等问题来提高我国的输血疗效。 尿素溶血试验 Jk(a-b-)表型的筛选:因稀有血型本身所具有特殊性,充分利用其特点设计出将其筛选出的方法,Kidd血型系统中Jk(a-b-),此种红细胞可在2M的尿素溶液中使其红细胞膜在6h以上的时间内保持完整性。而Jka和Jkb抗原的红细胞在2M尿素溶液中完全溶血的时间不超过30s。其操作过程为:选取RSP加样器设备将标本红细胞稀释到1%的悬液中,并在96孔微量板上加20ul悬液,再将100ul2mol/L尿素溶液加入其中,放置离心机中以800r/min转速离心3min,溶血为阳性,不溶血为阴性,如为阴性者则进一步对血细胞做分子生物学分析。本次通过Jk(a-b-)尿素筛选实验,获得8名Jk(a-b-)表型献血者。 试管法 将选取标本红细胞稀释为2-5%悬液,标记试管(抗-Mur、-Lub、-Rhmull、-Kell、-MN、-H)并加入相应抗血清和标本红细胞各50ul。采用直接离心法或间接抗球蛋白法,轻摇观察结果;发生凝集为阳性,反之为阴性,共发现稀·临床研究·有血型7例。 在我们对稀有血型筛选过程中,有4种稀有血型是采用筛选稀有等位基因的方法。通过采用PCR的定点诱变技术,我们成功构建出含有突变SNP位点的s和Oka血型等位基因的标准质粒,制备出稀有血型等位基因突变点片段,应用在对照分子生物学方法筛选稀有血型。组建多个多重PCR体系,检测等位基因。   应用问题 针对稀有血型的应用世界各地各有区别,繁简宽松不一。对于未经检测血液,有的国家如法国,紧急情况下,在得到国家输血机构主任同意后,可以使用被感染(艾滋病感染的除外)的献血者血液。而有的国家直接把决定权交给医生。另一方面,稀有血型的稀少导致在血液的储存、获取都存在了问题,这些问题正待解决。   小结 在当前来看,欧美、日本都发达国家都先后完成了各自的稀有血型库的筛选工作,这也预示着稀有血型的筛选工作也得到了世界各国原来越多的关注与重视,而英泰离心机在血细胞分离中起到关键作用。而随着当前IDP和ISBTW/P的逐步完善,使得稀有血型库的发展势头愈发强劲,稀有血型项目带来了安全输血史无前例的态势。对于中国来讲,人种和血型的多样化给我国的稀有血型的筛选工作带来了极大的便利,就当前而言,虽然我国大部分稀有血型尚不明确,但本次筛选也填补了空缺。并为X市血液中心筹建的“中国稀有血型库”提供相关基础数据。在解决临床稀有血型的输血问题时,稀有血型的筛选并建立相应的全国性的网络体系是极其重要的,而扩大筛选范围、增加验证体系都有助于我国稀有血型库的壮大。同时医用离心机技术参数和稳定性的提升都使实验过程得到了保障。
09-22

实验室几种常用的转染方法

转染(transfection)专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。从本质上讲,和转化没有根本的区别。无论是转染还是转化,其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞,以提高细胞膜的通透性,从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。今天我们来为大家介绍几种细胞转染的方法,供大家在实验室日常工作中使用。 一、物理-化学方法   脂质体转染法:采用脂质体转染试剂,将遗传物质如质粒, siRNA等转移至细胞内。   此种方法易于操作且不需要许多步骤或特殊的专业知识。通常情况下,你只需要一种转染试剂和一种兼容的生长培养基 (通常是低血清且具有良好的缓冲作用,使细胞在转染过程中保持活性)。不同的厂商有自己的配方试剂,有些可以为特定的细胞系设计配方,所以检查你的细胞系是否有最佳脂溶性配方。此外,这种方法可与一系列细胞兼容,如HEK 293.   脂质体转染试剂价格昂贵,但转染效率高,从长远来看是值得的。   DEAE-葡聚糖法:它是一种阳离子聚合物,可以与带负电荷的DNA和蛋白质结合,进而被细胞吞噬。   聚合物浓度、核酸或蛋白质与聚合物的比值,以及转染的持续时间是重要的优化参数,另外,此方法对附着细胞的转染非常有效,也可用于某些悬浮细胞系。   缺点是一些细胞类型对葡聚糖特别敏感,可能会发生形态变化或者抑制细胞生长。   磷酸钙共沉淀法:DNA与浓缩的氯化钙溶液混合,然后添加到含有磷酸盐离子的缓冲液中,形成磷酸钙-DNA沉淀物,从而被细胞吸收。   这种方法价格便宜且被广泛使用,但这种方法转染效率不稳定,可能会发生DNA 聚集等,影响转染的效率,对试剂浓度、PH值等的要求也比较高。   电穿孔法:将细胞短暂暴露于电场中,短脉冲使细胞膜暂时穿孔,可以吸收外来的遗传物质,此方法也适用于传递蛋白质。   目前有许多电穿孔装置,操作不需要专门的专业知识,但在购买之前一定要向供应商索要设备的演示,确保它对你的细胞系有效。最佳的电压、持续时间和脉冲数可以增加外来材料的渗透性,对每个不同的细胞系你需要仔细优化这些参数。但是并不是所有细胞都能忍受电穿孔,有些细胞会死亡,另外,电穿孔仪也是相对昂贵的。   二、生物方法   腺病毒转导:对于转染困难的细胞,利用病毒载体将遗传物质转移到哺乳动物细胞中   此方法存在病毒传播的风险,需要适当的安全预防措施。另外,需要包装细胞系产生能携带目的DNA的病毒颗粒。   成功转染的诀窍:   哺乳动物细胞系的转染并不简单,使用哪种方法取决于很多因素,例如: 你的实验室的预算、电穿孔设备、你的细胞类型等等,选择最适的转染方法会有较好的转染效率。   抗生素耐药性示例----筛选转染成功的细胞 引入遗传物质(通常是一个质粒)的同时细胞会产生一种耐抗生素的基因。在转染的最初阶段,细胞可能会有点“萎靡”,需要时间来恢复,一两天之后,你就可以把它们暴露在抗生素环境下。没有接受质粒的细胞将无法承受,并且会死亡,你就可以用转染的细胞继续你的实验。   2.尽早确定你的转染效率 比较不同转染方法的一个快速而简单的方法是使用一个携带荧光标记蛋白的质粒,这样你就可以在显微镜下观察转染的细胞。你可能需要尝试几种不同浓度的DNA / siRNA来确定你的细胞系的最佳转染效率。   3.尝试使用永生细胞系 与原始细胞系相比,永生细胞系无疑更容易工作,但仍然可能会观察到细胞毒性作用,影响整个转染效率。
09-22

多功能离心机的制作

  如图1、图2所示,本教具主要由A、两块用膨胀螺丝连接的木板B、转动电机C、风扇叶及隔热片D、石英管加热器E、钻孔的易拉罐F、电机三相插头及加热管插头G、一些螺丝、螺母、防震垫片、耐高温导线组成。   (一)离心机的支架 两块32cm×25cm木板,四个角分别钻一个孔,孔大小以膨胀螺丝大小为准。上方木板中间挖成镂空圆形,大小以风扇大小为准,以便电机和风扇穿过。用膨胀螺丝连接两块木板,组成离心机的外部支架。另外,下方木板底部膨胀螺丝的头部用哥俩好使其与防震垫片粘连。   (二)转动装置 采用单相罩极异步电机,具有小巧美观,结构紧凑,维护简单,起动转矩较小,噪音低,振动小的优势。在转动电机上安装风扇叶以及隔热片,防止石英管加热时电机过热,同时当离心机应用为“棉花糖机”时,可以将糖丝向上吹。 (三)加热装置 制作棉花糖机时,采用石英加热管,将其用绝缘胶带粘在上方木板上,便于拆卸。石英加热管的温度能达到1200℃。必须采用绝热导线与三相插头进行连接。 (四)顶部装置 装置①:将易拉罐侧面靠下方钻两或三排小孔,在下方距底部5em处用电锯割开成两半,取易拉罐的下半部分。在上方每隔2em剪开深约2em豁口,向内翻折,防止转动时罐内部物质从顶部飞出。在易拉罐底部中心位置打孔,将螺丝插入。完成后图3所示。 装置②:同样在易拉罐下方距底部5em处用电锯割开成两半,取下半部分,易拉罐底部两侧对称钻开两个孔,大小以试管大小为准,实验时方便试管的插入。易拉罐底部中心位置打孔,将螺丝插入。完成后如图4所示。 (五)装置优势 1.小巧美观,便携带 2.易于操作,元器件可视化,原理直观,符合课程设定,方便拆卸讲解 3.噪音小,稳定,可观赏性强 4.可拓展应用,开拓学生思路 三、实验演示及原理 (一)脱水机的演示 顶部采用装置①,把易拉罐底部螺丝与转动电机连接,无须加热装置,还需要一个底部掏空的塑料盆,用小磁钢使盆与木板连接,组成一个罩,防止水花飞溅。将一块湿布放在易拉罐中,开启转动电机,水从小罐侧面小孑L飞出,可听到水打到盆的“哗哗”声。关闭电机后取出布,布相较之前的状态变干,装置达到脱水机的效果。这是由于布上的水在高速旋转的小罐中产生离心现象,与布脱离,通过罐上的孔向外飞出,盆中会有很多被甩出的水。 (二)棉花糖机的演示 顶部采用装置①,把易拉罐底部螺丝与转动电机连接,需要加热装置,同样需要放置底部掏空塑料盆。先在罐内加入白砂糖,打开加热管预热两分钟预热,使砂糖融化成糖浆。然后关闭加热管,打开转动电机,可看到棉花糖丝飞出,用木棒或塑料棒将棉花糖卷出。由于糖浆被加热时香味四溢,学生跃跃欲试,开启转动电机后,糖浆在高速旋转的小罐中做离心运动,贴到小罐外壁,通过小罐外壁的细孔飞出,由于孔的直径很小,糖浆飞出瞬问遇到冷空气凝结成丝状物体,此时,使木棒在盆内环绕,便可得到一串松软的棉花糖。本 制作在研究文献和其它制作棉花糖机方法的基础上,进一步改进了以下问题: 1.改进了偏心问题,防止产生剧烈摇晃; 2.改进了出糖罐与中心轴不易连接的问题。可以保证出糖罐与转机同时转动 3.采用石英加热管,温度稳定,改善由于使用酒精灯导致的加热问题 4.防止由于使用酒精灯产生的危险性问题 (三)离心分离机的演示 顶部采用装置②,把易拉罐底部螺丝与转动电机连接,无须加热装置。在两孔内对称插入两个装有浑浊液的试管,如图5所示,在图中黑点部分用热熔胶将试管与易拉罐进行固定。开启转动电机,2分钟左右后关闭,取出试管,可以观察到试管内的溶液和沉淀明显分层。这是由于离心现象,使溶液和沉淀能够快速分离。   四、实验注意事项 1.易拉罐钻孔采用lmm钻头,孔过大会使糖浆直接飞出,而不能凝固成丝状。 2.石英加热管所能加热温度为1200~C左右,故导线采用耐高温导线连接,否则图5导线将被烧断,将石英加热管外侧金属壳接地,防止漏电。 3.风扇扇叶非必须添加。如若添加需在扇叶轴处加一层隔热垫片,添加风扇叶有利于棉花糖丝向上飞,但由于演示实验时间较短,不添加影响较小。 4.经多次测验,转动电机速度为600—800rad/s,适宜棉花糖出丝并且装置抖动较小。 5.偏心问题。偏心会导致易拉罐转动不稳定,易拉罐底部需提前测量中心,画出圆圈,尽量保证在圆心正中部位,避免偏心。
09-22

短臂离心机训练时男女心血管反应的比较

航空航天飞行中重力环境变化对飞行员、航天员的心血管功能提出了更高的要求,开展专项训练是提高心血管功能的有效途径之一。我们前期研制了人体短臂离心机(short-armcentrifuge,SAC)训练设备,并进行了相关实验研究,结果表明,SAC训练时前庭刺激(本实验指转头)对心血管功能存在一定的影响,Graybiel评分标准SAC暴露复合前庭刺激可增强心脏交感神经兴奋性,改善心血管功能,有助于提高训练效果。研究发现SAC联合运动锻炼3周可以增加外周血管交感神经活动水平,增强立位应激时血压调节能力,提高人体心血管功能储备[1~3]; 间断性SAC联合运动锻炼可有效维持4d模拟失重期间人体的心脏泵血和收缩功能、运动耐力以及下肢静脉顺应性[4,5]。然而,以往试验的对象均为男性,而国内到目前为止有关女性在SAC暴露时的相关实验数据仍是空白,并且以往的训练方案没有充分考虑男女飞行员身体素质方面的差异,不能充分发挥女飞行员的潜能。因此,为弥补这一空白,本实验的目的是比较男性和女性在SAC暴露时对心血管反应的差异及为女飞行员、航天员的训练提供参考。   对象24名健康志愿者,12名男性志愿者年龄(20±1)岁,身高(172±4)cm,体质量(64±6)kg。12名女性志愿者年龄(20±1)岁,身高(165±5)cm,体质量(56±5)kg,无心肺疾病史,无晕车晕船史。实验前24h及实验期间不饮用可影响自主神经功能的饮品,避免进行高强度体育运动或其他大体能消耗的活动,正常饮食。本实验在空军军医大学航空航天医学教育部重点实验室进行,实验内容经过空军军医大学医学伦理委员会审议和批准。所有被试者对实验内容完全知情并签署了知情同意书。SAC-Ⅲ型人体SAC由空军军医大学航空航天医学系研制。该装置为双转臂对称设计,臂长2m,通过电力驱动系统用来提供动力,最大转速为55r/min,约为足水平6G,躺椅固定于双转臂上,头朝向轴心,平躺时头部可自由转动。利用胸带式KF-2型动态多参数生理检测仪记录被试者在人体SAC上的生理参数(标准导联心电图、呼吸、体表温度等),并可通过自带的软件进行数据回顾和心率变异性分析等。采用BP5型iHealth无线血压计(天津九安电子股份有限公司)测量实验期间被试者血压的变化。   SAC暴露时对血压和心率的测量实验前被试者胸部佩戴KF-2型动态多参数生理检测仪,左侧上臂佩戴iHealth无线血压计,连接设备。被试者头朝向旋转轴心,平躺于SAC躺椅上处于安静状态10min后测量血压1次,记录相关数值。按照以下程序进行1次转速为31r/min(足水平2Gz)持续8min的SAC暴露,每分钟记录1次血压和心率的变化。被试者在SAC暴露时的前4min保持头部正位不动,记录被试者血压和心率等的变化。SAC复合左右转头45°在SAC暴露的后4min,被试者按照主试者指令每分钟内依次向左、右迅速转头45°(共8次,左右各4次)。   Graybiel评分标准记录被试者血压和心率的变化,并在离心机停止时询问被试者主观感受,根据其感受进行Graybiel评分,见表1。   统计学处理采用SPSS19.0统计分析软件对实验数据进行分析,数据以±s表示。心率、血压及心率变异性参数同性别组内比较采用重复测量方差分析,采用LSD检验进行组内两两比较。组间比较采用t检验。以P<0.05为差别具有统计学意义。   SAC暴露时对血压和心率的影响 SAC暴露时男性和女性血压和心率的变化趋势基本一致。单独SAC暴露时,男性和女性被试者收缩压和舒张压较暴露前均显著升高(P<0.05);心率呈升高趋势,但未达到显著水平;男性和女性收缩压、舒张压和心率的变化率均无显著性差异。SAC暴露复合前庭剌激时,男性和女性被试者收缩压和舒张压较暴露前均显著升高(P<0.05,P<0.01);心率呈升高趋势,未达到显著水平;男性和女性收缩压、舒张压和心率的变化率均无显著性差异。SAC复合前庭刺激时男性和女性被试者收缩压较单独SAC暴露时均呈现升高趋势,但未达到显著水平,见表2。   SAC暴露时心率变异性的影响 单独SAC暴露时,男性和女性被试者的心率变异性低频功率(LF)、低频功率/高频功率(LF/HF)较暴露前均显著升高(P<0.05,P<0.01),HF较暴露前均显著降低(P<0.05)。在SAC复合前庭刺激时,男性和女性被试者的LF、LF/HF较暴露前均显著升高(P<0.05,P<0.01),HF显著降低(P<0.01)。SAC复合前庭刺激时男性被试者的LF/HF较单独SAC暴露时显著升高(P<0.05),而女性则无明显变化,见表3。男性被试者SAC暴露复合前庭刺激时的LF/HF变化率较单独SAC暴露时的LF/HF变化率显著升高(P<0.05),单独SAC暴露时为62%,SAC暴露复合前庭刺激时的LF/HF变化率为113%。女性被试者SAC暴露复合前庭刺激时的LF/HF变化率较单独SAC暴露时的LF/HF变化率无明显变化,单独SAC暴露时为121%,SAC暴露复合前庭刺激时的LF/HF变化率为119%。单独SAC暴露时,女性被试者的LF/HF变化率显著高于男性(P<0.05)。SAC暴露复合前庭刺激时,男性被试者和女性被试者的LF/HF变化率无显著差别,见图1。 SAC 暴露时心血管自主调节功能的影响 単独 SAC 暴露时,被试者头部保持不动,除在离心机启动和停止阶段出现反旋转错觉外,暴露过程中被试者无明显前庭反应。被试者向左或向右迅速转头45°时,均产生了明显的科里奥利翻转错觉,即在向左转头时有身体后仰的错觉,头部回正时有身体前倾的错觉;右转头时则相反,见表 4。
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