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• 发布时间：2020-09-12
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【概要描述】  免疫手术法(immunnosurgery)是用免疫学的手段，特异性地仅分离某种细胞及其集团，而达到采取目的细胞和组织的方法。本文以大鼠为主，叙述抗体的制作、通过离心机分离来自使用抗体的滋养层细胞的内细胞团的方法。

 

    一、  装置、器具

    (一)装置

    (1)相差倒置显微镜；

    (2)匀浆器(疣状玻璃制品)1个

 

    (二)器械、器具

    (1)剪刀，大小计6把；

    (2)前端弯曲和直的镊子，中小各2-3把；

    (3)血球计数板1块；

    (4)不锈钢金属网(80μM)1只(眼子细的不锈钢茶滤网亦可)；

    (5)酒精灯1个；

    (6)烧杯200ml 2个；

    (7)离心机配50ml塑料离心管；

    (8)移液管l0支；

    (9)平皿90mm 2个。

 

    二、  试剂

    (一)试剂种类：

    (1)50 mM磷酸缓冲生理盐水(PBS)(pH7.4,100ml)；

    (2)溶血液；

    (3)0.25％台盼蓝—PBS溶液；

    (4)70％酒精。

 

    (二)试剂的配制

    (1)溶血液：90ml0.16M NH4Cl溶液和10ml0.17M三羟甲基甲烷(Tris)的溶液(pH 7．

65)混合，用HCl调节pH至7.2。

    (2)0.25％台盼蓝溶液；

    用PBS溶解台盼蓝、使之成0.25％台盼蓝溶液。

 

    三、  动物

    (1)正常成熟的大鼠5只(供给淋巴细胞用)。

    (2)家免2只，体重3kg以上，雌、雄均可(产生抗体用)。

 

    四、操作方法

    (一)制备淋巴细胞

    (1)摘出脾脏  由放血处死的大鼠，在无菌情况下摘取。

    (2)把摘出的脾脏连同平皿一起迅速地移至冰冷的PBS液中，除去血液和夹杂物。

    (3)把脾脏放进不锈钢网内．用玻璃制的匀浆器压碎，使细胞离散。此时，若将脾脏切成4—5块，压碎更好。

    (4)用移液管抽吸  通过1网眼的淋巴细胞大体上全部散开，但为使其完全分散，应用吸管反复吸、排。

    (5)离心  把步骤〔4)的处理液(细胞分散液)移至50mI离心管中，通过离心机1200rpm离心10分钟，弃去上清液。

    (6)溶血处理  打开离心机在步骤(5)的离心管中加20ml溶血液，搅拌，静置5—10分钟后，离心。通过步骤(5)离心分离的细胞团因有红细胞混入，必须把它除去。经过溶血处理，若红细胞已被完全除去，细胞团则呈乳白色。另外，若认为还有红细胞混入时，则应反复进行本操作。

    (7)洗涤淋巴细胞  把进行过溶血操作的细胞团一次加10ml PB5，洗涤3次。

    (8)淋巴细胞数和生存率的判断法  洗净的淋巴细胞使之在10mLPBS液中悬浮。取其0.1-0.3m1，加PBS稀释50—100倍。

    取该稀释液的一部分(2—3ml)，加等量的台盼蓝液混合。

    取上液1滴在血球计数板上，用相差显微镜观察。同时计数全细胞数和死亡细胞数。死亡细胞呈蓝染。用本法可获得90％以上的生存率。

    (9)调整细胞数  用上述处理1只大鼠能采取约30—50亿个淋巴细胞，用PBS调整细胞数为1亿／mL。

 

    (二)免疫法(淋巴细胞法)

    (1)投予淋巴细胞(静脉注射)：用上述步骤调整的5—10亿(5—10ml)个淋巴细胞，从家免耳静脉缓缓注射。这时，使用安装有23G针头的10ml注射器。

 

    (2)给予的次数  上述的处理按每周1次，连续4次。

 

    (三)测定抗体效价

    最后一次应用淋巴细胞后，约第3—7日从耳静脉采血，测定抗体效价。

 

    (四)采血

    抗体效价适宜的话，可在防止溶血的情况下进行采血。从家免采全血，可用颈静脉插管法，或者心脏采血。

 

    (五)抗血清的分离、灭活及保存

    (1)分离  用离心机3000rpm，离心20-25分钟

    (2)灭活

    (3)保存