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玻璃粉末洗脱法回收DNA片段

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玻璃粉末洗脱法回收DNA片段

  • 分类:新闻资讯
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2020-09-13
  • 访问量:314

【概要描述】 本法利用琼脂糖凝胶溶于Nal,其中DNA可专一性地与玻璃粉末结合,经洗涤去杂质后,再用低盐洗脱液从玻璃粉末上将DNA洗脱下来,达到回收DNA片段的目的。溶液中的DNA也可用本法纯化,如准备作序列分析的M13DNA。

试剂:

    预洗过的325目粉状燧石玻璃粉末(IBI公司)

    TF缓冲液

    碘化钠溶液:

    90.8g Nal

    15g Na2S

    用水调容积至1 COOmlWhatman 1号滤纸或0.45um滤膜过滤,再加0.5g碘化钠至饱和,4℃下,用铝铂纸包住避光保存。

    乙醇洗涤溶液:

    50ml乙醇中古:

    20rrmoUL Tns (pH7.4)

    1mmol/L EDTA

    0.1mol/L Nacl

    于-20℃储存。

    3mol/L NaAc (pH7.4)

    乙醇

操作步骤:

    (1)琼脂糖凝胶电泳分离DNA后,在长波紫外线灯下,切下含所需DNA带的凝胶条(体积尽可能小)。

    (2)按每克琼脂糖凝胶条,加2ml Nal溶液的比例加入Nal溶液.37℃保温60分钟溶解凝胶。应注意:保温过程应避光,TBE配制的凝胶不易溶解。

    (3)用水将玻璃粉末稀释成50%的糊状(v/v),摇匀,按每1ug DNA加3ul玻璃糊状液的比例,向溶解好的凝胶DNA混合液中加入玻璃糊状液混匀,冰浴放置90分钟。

    (4) EppendoIf离心机,5000r/min,4℃离心1分钟,弃上清。

    (5)加入4℃预冷的40ul乙醇洗涤溶液,悬浮玻璃粉末,5000r/min,离心1分钟,重复漂洗2次。

    (6)在玻璃沉淀物中,加入25ul TE混匀,37℃保温30分钟。

    (7)5 000r/min,离心1分钟,上清液移入1个清洁的Eppendorf管中,此时样品可再用乙醇沉淀。

    (8)加3pel 3moUL NaAe,75yl乙醇混合,于冰上10分钟。

    (9)12 000r/min,4℃离心10分钟,倾弃液体,沉淀室温挥发乙醇后,溶于适当容积的T缓冲液中。

注意事项:

    (1)若选用玻璃粉末回收法进行凝胶电泳分离DNA时,不能使用TBE缓冲液,因为硼酸缓冲液配制的凝胶(琼脂糖或丙烯酰胺)在Nal溶液中均不能完全溶解。

    (2)步骤(3)中加入过量的玻璃粉末,并不能增加DNA的回收率。

玻璃粉末洗脱法回收DNA片段

【概要描述】 本法利用琼脂糖凝胶溶于Nal,其中DNA可专一性地与玻璃粉末结合,经洗涤去杂质后,再用低盐洗脱液从玻璃粉末上将DNA洗脱下来,达到回收DNA片段的目的。溶液中的DNA也可用本法纯化,如准备作序列分析的M13DNA。

试剂:

    预洗过的325目粉状燧石玻璃粉末(IBI公司)

    TF缓冲液

    碘化钠溶液:

    90.8g Nal

    15g Na2S

    用水调容积至1 COOmlWhatman 1号滤纸或0.45um滤膜过滤,再加0.5g碘化钠至饱和,4℃下,用铝铂纸包住避光保存。

    乙醇洗涤溶液:

    50ml乙醇中古:

    20rrmoUL Tns (pH7.4)

    1mmol/L EDTA

    0.1mol/L Nacl

    于-20℃储存。

    3mol/L NaAc (pH7.4)

    乙醇

操作步骤:

    (1)琼脂糖凝胶电泳分离DNA后,在长波紫外线灯下,切下含所需DNA带的凝胶条(体积尽可能小)。

    (2)按每克琼脂糖凝胶条,加2ml Nal溶液的比例加入Nal溶液.37℃保温60分钟溶解凝胶。应注意:保温过程应避光,TBE配制的凝胶不易溶解。

    (3)用水将玻璃粉末稀释成50%的糊状(v/v),摇匀,按每1ug DNA加3ul玻璃糊状液的比例,向溶解好的凝胶DNA混合液中加入玻璃糊状液混匀,冰浴放置90分钟。

    (4) EppendoIf离心机,5000r/min,4℃离心1分钟,弃上清。

    (5)加入4℃预冷的40ul乙醇洗涤溶液,悬浮玻璃粉末,5000r/min,离心1分钟,重复漂洗2次。

    (6)在玻璃沉淀物中,加入25ul TE混匀,37℃保温30分钟。

    (7)5 000r/min,离心1分钟,上清液移入1个清洁的Eppendorf管中,此时样品可再用乙醇沉淀。

    (8)加3pel 3moUL NaAe,75yl乙醇混合,于冰上10分钟。

    (9)12 000r/min,4℃离心10分钟,倾弃液体,沉淀室温挥发乙醇后,溶于适当容积的T缓冲液中。

注意事项:

    (1)若选用玻璃粉末回收法进行凝胶电泳分离DNA时,不能使用TBE缓冲液,因为硼酸缓冲液配制的凝胶(琼脂糖或丙烯酰胺)在Nal溶液中均不能完全溶解。

    (2)步骤(3)中加入过量的玻璃粉末,并不能增加DNA的回收率。

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 本法利用琼脂糖凝胶溶于Nal,其中DNA可专一性地与玻璃粉末结合,经洗涤去杂质后,再用低盐洗脱液从玻璃粉末上将DNA洗脱下来,达到回收DNA片段的目的。溶液中的DNA也可用本法纯化,如准备作序列分析的M13DNA。

试剂:

    预洗过的325目粉状燧石玻璃粉末(IBI公司)

    TF缓冲液

    碘化钠溶液:

    90.8g Nal

    15g Na2S

    用水调容积至1 COOmlWhatman 1号滤纸或0.45um滤膜过滤,再加0.5g碘化钠至饱和,4℃下,用铝铂纸包住避光保存。

    乙醇洗涤溶液:

    50ml乙醇中古:

    20rrmoUL Tns (pH7.4)

    1mmol/L EDTA

    0.1mol/L Nacl

    于-20℃储存。

    3mol/L NaAc (pH7.4)

    乙醇

操作步骤:

    (1)琼脂糖凝胶电泳分离DNA后,在长波紫外线灯下,切下含所需DNA带的凝胶条(体积尽可能小)。

    (2)按每克琼脂糖凝胶条,加2ml Nal溶液的比例加入Nal溶液.37℃保温60分钟溶解凝胶。应注意:保温过程应避光,TBE配制的凝胶不易溶解。

    (3)用水将玻璃粉末稀释成50%的糊状(v/v),摇匀,按每1ug DNA加3ul玻璃糊状液的比例,向溶解好的凝胶DNA混合液中加入玻璃糊状液混匀,冰浴放置90分钟。

    (4) EppendoIf离心机,5000r/min,4℃离心1分钟,弃上清。

    (5)加入4℃预冷的40ul乙醇洗涤溶液,悬浮玻璃粉末,5000r/min,离心1分钟,重复漂洗2次。

    (6)在玻璃沉淀物中,加入25ul TE混匀,37℃保温30分钟。

    (7)5 000r/min,离心1分钟,上清液移入1个清洁的Eppendorf管中,此时样品可再用乙醇沉淀。

    (8)加3pel 3moUL NaAe,75yl乙醇混合,于冰上10分钟。

    (9)12 000r/min,4℃离心10分钟,倾弃液体,沉淀室温挥发乙醇后,溶于适当容积的T缓冲液中。

注意事项:

    (1)若选用玻璃粉末回收法进行凝胶电泳分离DNA时,不能使用TBE缓冲液,因为硼酸缓冲液配制的凝胶(琼脂糖或丙烯酰胺)在Nal溶液中均不能完全溶解。

    (2)步骤(3)中加入过量的玻璃粉末,并不能增加DNA的回收率。

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