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离心机分离淋巴细胞制作抗体

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离心机分离淋巴细胞制作抗体

  • 分类:新闻资讯
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  • 来源:
  • 发布时间:2020-09-12
  • 访问量:309

【概要描述】  免疫手术法(immunnosurgery)是用免疫学的手段,特异性地仅分离某种细胞及其集团,而达到采取目的细胞和组织的方法。本文以大鼠为主,叙述抗体的制作、通过离心机分离来自使用抗体的滋养层细胞的内细胞团的方法。

 

    一、  装置、器具

    (一)装置

    (1)相差倒置显微镜;

    (2)匀浆器(疣状玻璃制品)1个

 

    (二)器械、器具

    (1)剪刀,大小计6把;

    (2)前端弯曲和直的镊子,中小各2-3把;

    (3)血球计数板1块;

    (4)不锈钢金属网(80μM)1只(眼子细的不锈钢茶滤网亦可);

    (5)酒精灯1个;

    (6)烧杯200ml 2个;

    (7)离心机配50ml塑料离心管;

    (8)移液管l0支;

    (9)平皿90mm 2个。

 

    二、  试剂

    (一)试剂种类:

    (1)50 mM磷酸缓冲生理盐水(PBS)(pH7.4,100ml);

    (2)溶血液;

    (3)0.25%台盼蓝—PBS溶液;

    (4)70%酒精。

 

    (二)试剂的配制

    (1)溶血液:90ml0.16M NH4Cl溶液和10ml0.17M三羟甲基甲烷(Tris)的溶液(pH 7.

65)混合,用HCl调节pH至7.2。

    (2)0.25%台盼蓝溶液;

    用PBS溶解台盼蓝、使之成0.25%台盼蓝溶液。

 

    三、  动物

    (1)正常成熟的大鼠5只(供给淋巴细胞用)。

    (2)家免2只,体重3kg以上,雌、雄均可(产生抗体用)。

 

    四、操作方法

    (一)制备淋巴细胞

    (1)摘出脾脏  由放血处死的大鼠,在无菌情况下摘取。

    (2)把摘出的脾脏连同平皿一起迅速地移至冰冷的PBS液中,除去血液和夹杂物。

    (3)把脾脏放进不锈钢网内.用玻璃制的匀浆器压碎,使细胞离散。此时,若将脾脏切成4—5块,压碎更好。

    (4)用移液管抽吸  通过1网眼的淋巴细胞大体上全部散开,但为使其完全分散,应用吸管反复吸、排。

    (5)离心  把步骤〔4)的处理液(细胞分散液)移至50mI离心管中,通过离心机1200rpm离心10分钟,弃去上清液。

    (6)溶血处理  打开离心机在步骤(5)的离心管中加20ml溶血液,搅拌,静置5—10分钟后,离心。通过步骤(5)离心分离的细胞团因有红细胞混入,必须把它除去。经过溶血处理,若红细胞已被完全除去,细胞团则呈乳白色。另外,若认为还有红细胞混入时,则应反复进行本操作。

    (7)洗涤淋巴细胞  把进行过溶血操作的细胞团一次加10ml PB5,洗涤3次。

    (8)淋巴细胞数和生存率的判断法  洗净的淋巴细胞使之在10mLPBS液中悬浮。取其0.1-0.3m1,加PBS稀释50—100倍。

    取该稀释液的一部分(2—3ml),加等量的台盼蓝液混合。

    取上液1滴在血球计数板上,用相差显微镜观察。同时计数全细胞数和死亡细胞数。死亡细胞呈蓝染。用本法可获得90%以上的生存率。

    (9)调整细胞数  用上述处理1只大鼠能采取约30—50亿个淋巴细胞,用PBS调整细胞数为1亿/mL。

 

    (二)免疫法(淋巴细胞法)

    (1)投予淋巴细胞(静脉注射):用上述步骤调整的5—10亿(5—10ml)个淋巴细胞,从家免耳静脉缓缓注射。这时,使用安装有23G针头的10ml注射器。

 

    (2)给予的次数  上述的处理按每周1次,连续4次。

 

    (三)测定抗体效价

    最后一次应用淋巴细胞后,约第3—7日从耳静脉采血,测定抗体效价。

 

    (四)采血

    抗体效价适宜的话,可在防止溶血的情况下进行采血。从家免采全血,可用颈静脉插管法,或者心脏采血。

 

    (五)抗血清的分离、灭活及保存

    (1)分离  用离心机3000rpm,离心20-25分钟

    (2)灭活

    (3)保存

离心机分离淋巴细胞制作抗体

【概要描述】  免疫手术法(immunnosurgery)是用免疫学的手段,特异性地仅分离某种细胞及其集团,而达到采取目的细胞和组织的方法。本文以大鼠为主,叙述抗体的制作、通过离心机分离来自使用抗体的滋养层细胞的内细胞团的方法。

 

    一、  装置、器具

    (一)装置

    (1)相差倒置显微镜;

    (2)匀浆器(疣状玻璃制品)1个

 

    (二)器械、器具

    (1)剪刀,大小计6把;

    (2)前端弯曲和直的镊子,中小各2-3把;

    (3)血球计数板1块;

    (4)不锈钢金属网(80μM)1只(眼子细的不锈钢茶滤网亦可);

    (5)酒精灯1个;

    (6)烧杯200ml 2个;

    (7)离心机配50ml塑料离心管;

    (8)移液管l0支;

    (9)平皿90mm 2个。

 

    二、  试剂

    (一)试剂种类:

    (1)50 mM磷酸缓冲生理盐水(PBS)(pH7.4,100ml);

    (2)溶血液;

    (3)0.25%台盼蓝—PBS溶液;

    (4)70%酒精。

 

    (二)试剂的配制

    (1)溶血液:90ml0.16M NH4Cl溶液和10ml0.17M三羟甲基甲烷(Tris)的溶液(pH 7.

65)混合,用HCl调节pH至7.2。

    (2)0.25%台盼蓝溶液;

    用PBS溶解台盼蓝、使之成0.25%台盼蓝溶液。

 

    三、  动物

    (1)正常成熟的大鼠5只(供给淋巴细胞用)。

    (2)家免2只,体重3kg以上,雌、雄均可(产生抗体用)。

 

    四、操作方法

    (一)制备淋巴细胞

    (1)摘出脾脏  由放血处死的大鼠,在无菌情况下摘取。

    (2)把摘出的脾脏连同平皿一起迅速地移至冰冷的PBS液中,除去血液和夹杂物。

    (3)把脾脏放进不锈钢网内.用玻璃制的匀浆器压碎,使细胞离散。此时,若将脾脏切成4—5块,压碎更好。

    (4)用移液管抽吸  通过1网眼的淋巴细胞大体上全部散开,但为使其完全分散,应用吸管反复吸、排。

    (5)离心  把步骤〔4)的处理液(细胞分散液)移至50mI离心管中,通过离心机1200rpm离心10分钟,弃去上清液。

    (6)溶血处理  打开离心机在步骤(5)的离心管中加20ml溶血液,搅拌,静置5—10分钟后,离心。通过步骤(5)离心分离的细胞团因有红细胞混入,必须把它除去。经过溶血处理,若红细胞已被完全除去,细胞团则呈乳白色。另外,若认为还有红细胞混入时,则应反复进行本操作。

    (7)洗涤淋巴细胞  把进行过溶血操作的细胞团一次加10ml PB5,洗涤3次。

    (8)淋巴细胞数和生存率的判断法  洗净的淋巴细胞使之在10mLPBS液中悬浮。取其0.1-0.3m1,加PBS稀释50—100倍。

    取该稀释液的一部分(2—3ml),加等量的台盼蓝液混合。

    取上液1滴在血球计数板上,用相差显微镜观察。同时计数全细胞数和死亡细胞数。死亡细胞呈蓝染。用本法可获得90%以上的生存率。

    (9)调整细胞数  用上述处理1只大鼠能采取约30—50亿个淋巴细胞,用PBS调整细胞数为1亿/mL。

 

    (二)免疫法(淋巴细胞法)

    (1)投予淋巴细胞(静脉注射):用上述步骤调整的5—10亿(5—10ml)个淋巴细胞,从家免耳静脉缓缓注射。这时,使用安装有23G针头的10ml注射器。

 

    (2)给予的次数  上述的处理按每周1次,连续4次。

 

    (三)测定抗体效价

    最后一次应用淋巴细胞后,约第3—7日从耳静脉采血,测定抗体效价。

 

    (四)采血

    抗体效价适宜的话,可在防止溶血的情况下进行采血。从家免采全血,可用颈静脉插管法,或者心脏采血。

 

    (五)抗血清的分离、灭活及保存

    (1)分离  用离心机3000rpm,离心20-25分钟

    (2)灭活

    (3)保存

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  免疫手术法(immunnosurgery)是用免疫学的手段,特异性地仅分离某种细胞及其集团,而达到采取目的细胞和组织的方法。本文以大鼠为主,叙述抗体的制作、通过离心机分离来自使用抗体的滋养层细胞的内细胞团的方法。

 

    一、  装置、器具

    (一)装置

    (1)相差倒置显微镜;

    (2)匀浆器(疣状玻璃制品)1个

 

    (二)器械、器具

    (1)剪刀,大小计6把;

    (2)前端弯曲和直的镊子,中小各2-3把;

    (3)血球计数板1块;

    (4)不锈钢金属网(80μM)1只(眼子细的不锈钢茶滤网亦可);

    (5)酒精灯1个;

    (6)烧杯200ml 2个;

    (7)离心机配50ml塑料离心管;

    (8)移液管l0支;

    (9)平皿90mm 2个。

 

    二、  试剂

    (一)试剂种类:

    (1)50 mM磷酸缓冲生理盐水(PBS)(pH7.4,100ml);

    (2)溶血液;

    (3)0.25%台盼蓝—PBS溶液;

    (4)70%酒精。

 

    (二)试剂的配制

    (1)溶血液:90ml0.16M NH4Cl溶液和10ml0.17M三羟甲基甲烷(Tris)的溶液(pH 7.

65)混合,用HCl调节pH至7.2。

    (2)0.25%台盼蓝溶液;

    用PBS溶解台盼蓝、使之成0.25%台盼蓝溶液。

 

    三、  动物

    (1)正常成熟的大鼠5只(供给淋巴细胞用)。

    (2)家免2只,体重3kg以上,雌、雄均可(产生抗体用)。

 

    四、操作方法

    (一)制备淋巴细胞

    (1)摘出脾脏  由放血处死的大鼠,在无菌情况下摘取。

    (2)把摘出的脾脏连同平皿一起迅速地移至冰冷的PBS液中,除去血液和夹杂物。

    (3)把脾脏放进不锈钢网内.用玻璃制的匀浆器压碎,使细胞离散。此时,若将脾脏切成4—5块,压碎更好。

    (4)用移液管抽吸  通过1网眼的淋巴细胞大体上全部散开,但为使其完全分散,应用吸管反复吸、排。

    (5)离心  把步骤〔4)的处理液(细胞分散液)移至50mI离心管中,通过离心机1200rpm离心10分钟,弃去上清液。

    (6)溶血处理  打开离心机在步骤(5)的离心管中加20ml溶血液,搅拌,静置5—10分钟后,离心。通过步骤(5)离心分离的细胞团因有红细胞混入,必须把它除去。经过溶血处理,若红细胞已被完全除去,细胞团则呈乳白色。另外,若认为还有红细胞混入时,则应反复进行本操作。

    (7)洗涤淋巴细胞  把进行过溶血操作的细胞团一次加10ml PB5,洗涤3次。

    (8)淋巴细胞数和生存率的判断法  洗净的淋巴细胞使之在10mLPBS液中悬浮。取其0.1-0.3m1,加PBS稀释50—100倍。

    取该稀释液的一部分(2—3ml),加等量的台盼蓝液混合。

    取上液1滴在血球计数板上,用相差显微镜观察。同时计数全细胞数和死亡细胞数。死亡细胞呈蓝染。用本法可获得90%以上的生存率。

    (9)调整细胞数  用上述处理1只大鼠能采取约30—50亿个淋巴细胞,用PBS调整细胞数为1亿/mL。

 

    (二)免疫法(淋巴细胞法)

    (1)投予淋巴细胞(静脉注射):用上述步骤调整的5—10亿(5—10ml)个淋巴细胞,从家免耳静脉缓缓注射。这时,使用安装有23G针头的10ml注射器。

 

    (2)给予的次数  上述的处理按每周1次,连续4次。

 

    (三)测定抗体效价

    最后一次应用淋巴细胞后,约第3—7日从耳静脉采血,测定抗体效价。

 

    (四)采血

    抗体效价适宜的话,可在防止溶血的情况下进行采血。从家免采全血,可用颈静脉插管法,或者心脏采血。

 

    (五)抗血清的分离、灭活及保存

    (1)分离  用离心机3000rpm,离心20-25分钟

    (2)灭活

    (3)保存

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