台式冷冻离心机提取硝酸还原酶及测定

实验原理及目的

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关接性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它的提取可以利用台式冷冻离心机将其从其他组分分离出来，它作用于NO3-；使之还原为NO2-；产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应液中NO2-含量的增加。即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。

要求学习学握利用台式冷冻离心机离心提取硝酸还原酶的方法及原理，掌握硝酸还原酶测定方法。

   器材与试剂

1.实验仪器  台式冷冻离心机，石英砂，纱命，研钵

2．实验试剂  提取液：25mol/L磷酸缓冲液，1mol/L EDTA，10mol/L半胱氨酶(PH8.8)，0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)，0.1mol/L KN03(10.11g KN03溶于上述1000mL磷酸缓冲液中)，2mg/mLNADH(2mg NADH溶于1mL水中)

3.实验材料  蓖麻、向日葵、油菜、小麦或棉花的叶片

   实验步骤

1.酶的提取  把材料剪下，洗净，用吸水纸吸干，切成小块。称取0.5g放于研钵中，冰冻30 min。然后加入适量石英砂和提取液(共0.4ml)，磨成匀浆。匀浆用二层纱布过滤，利用台式冷冻离心机在0-4℃，4000r/min的参数下，冷冻离心20min，得到的上清液即为酶的粗提液。注意：硝酸还原酶是诱导酶，试验前一大最好在培养液中加NO3-以诱导酶的产生。

2. NO2-含量的测定  吸取酶粗提液0.2mL，于一试管中，加入0．5mL KN03溶液，0.3mL NADH，混合后在25℃保温30min：保温结束后立即加入磺胺试剂2m1及α—萘胺试剂2mL，混合摇匀，静置15min，用分光光废计(520 nm)进行比色测定，记下OD值．以不加NADH的(加入0.2mL水)作为主

白对照：从标准曲线上读出NO2-；含量，再计算酶活力，以每小时每克鲜重产生的NO2- μg或μmol表示。