“V”字形内槽电洗脱法

原理：

本法使用1个特殊的电洗脱装置（如图），其原理是在V字内槽的底部加人高离子浓度的电泳缓冲液，其上部分及整个电泳外槽中加入低离子浓度电泳液，DNA迁移至高离子浓度溶液部分

时，由于此处电荷多，电阻极小，电压降很小，DNA迁移率急剧下降，在2小时内，DNA几乎不能迁移出该高离子浓度溶液，从而达到回收并浓缩DNA的目的。其优点足：不需透析膜，同时可以回收多个不同的DNA样品，回收率高，也可以用于RNA及蛋白质特定分子的回收，洗脱体积小(50ul)，具有浓缩功能，洗脱时间短（30分钟），操作简单安全。回收的DNA的纯度适用于分子生物学中大多数工具酶反应。

试剂：

高盐电洗脱缓冲液：

7.5mol/L醋酸铵

1%甘油

10mmol/L Tris-CI (pH7.8)

0.05%溴酚蓝

0.1或0 5×TBE电泳缓冲液

酚、氯仿、乙醇

操作步骤：

(1)在长波紫外线灯下，切割下含所需DNA带的凝胶条，将凝胶条置于“V”字内槽负极端贮胶室

中。

(2)用带长针头的注射器或枪头上套细长硅胶管的微量移液枪，向“V”字内槽管底加入50 ~ 100ul高盐电洗脱液，然后用0.1或0.5×TBE充满“V”字内槽，最后在电泳装置中灌入0.1或

0.5×TBE至恰好与置胶室巾凝胶表面相平，注意不要使TBE溢过中央隔板。

(3)接通电源，100V电源洗脱20~40分钟，用手提式长波紫外线灯检查凝胶条中DNA带是否完全洗脱。若需长时间电洗脱，“V”字内槽底部的高盐洗脱液中溴酚蓝，在2小时内也不会迁移或

扩散至TBE中。

(4)放出电泳装置中的TBE，用微量加样器吸出“V”字内槽中的上层TBE，然后吸出下层含溴酚蓝的高盐洗脱液移至1个清洁的Eppendorf管巾，加入l倍容积TE冲洗“V”字槽，合并两部分

液体。

(5)用酚、酚f氯仿、氯仿分别抽提DNA电洗脱液各1次。

(6)上清加2倍容积的无水乙醇，- 20℃放置30分钟，12000g，室温下使用离心机离心10分钟。70%乙醇漂洗DNA沉淀1次，1200g，室温离心5分钟，弃上清，真空干燥乙醇2分钟，加入适当

容积的TE(pH 7.6)溶解DNA。

注意事项：

(1)在v字内槽中加入上层0.1×TBE时，应小心勿搅动下层的高盐电洗脱液，最好是v字槽两侧同时加入，也可以先在“v”字内槽中充满O.l×TBE，然后用针头插入“V”字内槽底部缓慢加人高盐电洗脱液，在“V”字内槽中不应有气泡存在。

(2)溴酚监足指示剂，若下层高盐电洗脱盐中溴酚蓝没有迁移至TBE中，标志着废溶液巾离子浓度未扩散稀释，DNA分子不会迁移出去。