低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法回收DNA片段

在琼脂糖主链导人羟乙基修饰后，其凝固温度降为30℃，融化温度为65℃，这一融化温度低于绝大多数双链DNA的变性温度。利用这类凝胶纯度高熔点低特点，Wieslrnder等人发展了一项颇为简单的DNA片段回收技术，回收DNA质量对于DNA的连接、探针标记以及内切酶消化等反应完全适合。本方法中分离所使用的离心机欢迎大家选购英泰离心机。

操作步骤：

(1)先灌制普通凝胶，然后在离加样孔适当距离处切下一定大小的普通凝胶，用相应浓度的低熔点琼脂糖填充，室温中凝固，4℃可加速凝固，凝胶中含0.5ug/ml溴乙锭。

(2)将待分离的DNA样品上样电泳，当感兴趣的DNA片段迁移至低熔点凝胶内，停止电泳、电泳最好在4℃下进行，以防低熔点凝胶溶化。

(3)在长波紫外线灯下，切下含所需DNA片段的低熔点凝胶，移入1个1.5ml的Epp endorf管中。

(4)加入凝胶条5倍容积的20mmol/L TrisCl (pH8.0)，1mmo/L EDTA( pH8.0)，65℃水浴巾加温5分钟熔化凝胶。

(5)冷到室温时加入等容积的0.1mol/L Tris．Cl（pH8.0)饱和的酚，强烈振荡混匀20秒钟，室温下4000g，离心10分钟，有机相与水相交界面为白色的低熔点琼脂糖粉末。

(6)用等容积酚，氯仿、氯仿各抽提1次。

(7)上层水相转移至1个清洁的Eppendorf管中，加入0.2容积的1Omol/L醋酸铵，2倍容积在预冷的无水乙醇，混匀后，室温下放置10分钟。4℃，12 000r/min，离心20分钟，回收沉淀DNA，弃上清。DNA用70%乙醇漂洗1次，12 000g．离心5分钟，去乙醇，真空干燥2分钟，加适当容积TE溶解。若必要，可进一步经DEAE - Sephacryl柱层析纯化。

近年来，此法有些经验和改进值得借鉴。Parker与Suuhl等的经验表明，含DNA的低熔点凝胶条经熔化后，可直接加入酶反应缓冲液中进行DNA连接、探针标记及内切酶消化等反应，大大简化了DFIA回收的操作程序。1989年Burmeister等报道另一种从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA片段的方法：

①将低熔点凝腔条（含所需DNA片段）移入20倍容积的lOmmol/L Tns．CI (pH7.6)，5mmol/L EDTA (pH8.0)，0.1mol/L NaCl溶液中，室温放置30分钟；

②取出凝胶条移人1个清洁的Eppendorf管中，加入1倍容积的l0mmol/L Tris．Cl(pH7.6)．5mmol/L EDTA（pH8.0），0.1mol/L NaCI溶液；

③加入无DNA酵的琼脂糖酶（agarase Cal Biochem公司），l00ml的凝胶用2个单位，37℃消化12 - 61小时，使琼脂糖裂解成单糖。此时可以直接用于连接，补平酶切等反应及转化实验。

④若需要，经酚，氯仿、氯仿分别抽提后，上清中加入2倍容积的TE( pH7.6)，然后加入0.05容积的5mol/LNaCl，2倍容积乙醇混匀，0℃放置15分钟沉淀DNA，12 000g，4℃离心15分钟。小心吸弃上清，DNA沉淀用70%乙醇漂洗1次。12000g，离心5分钟，弃卜清。室温下蒸发乙醇，DNA溶于适当容积的TE (pH7.6)中。